羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗冻干曲线的筛选试验研究

张述斌，冯玲霞，蒙琦

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000）

羊传染性脓疱皮炎耐热性活疫苗冻干曲线的筛选试验研究

张述斌，冯玲霞，蒙琦

（甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000）

采用冷冻干燥技术，设置了三条不同的冻干曲线，以培养的羊传染性脓疱皮炎（Orf）弱毒为对象，通过冻型、色泽、质地、水分含量、真空度、冻干时间长短、冻干前后病毒损失量为参数，筛选适合羊Orf耐热性活疫苗的最佳冻干曲线，生产出符合质量要求的冻干疫苗。试验结果显示：利用不同曲线冻干的羊Orf耐热性活疫苗，体积几乎没有发生变化，颜色一致，疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，且立即恢复原来的状态；在耐老化试验中疫苗均表现出了很好的耐热保护性能，虽然在冻干前后病毒损失量略有不同，但差异不明显。因此，通过冻型好、冻干前后病毒损失量较小、冻干时间短，最终确定冻干曲线1为羊Orf耐热性活疫苗的最佳冻干曲线。

冷冻干燥技术；冻干曲线；羊Orf耐热性活疫苗

冷冻干燥技术最早于1813年由英国人Wollaston发明，1909年Shsckell试验用该方法对抗毒素、菌种、狂犬病毒及其它生物制品进行冻干保存，取得了较好效果。随着生物科学技术水平的高速发展，冷冻干燥(Lyophilization)技术目前已广泛用于生物学、药学、医学、材料、食品等领域，特别适于热稳定性差、易氧化的物质，由于冷冻干燥可除去产品中的水分，使产品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术被广泛应用于生物制品特别是活疫苗生产中，但是在具体应用中还存在着诸多问题，为防止制品变性，提高制品的稳定性和经济性，必须对制品在冻干过程中的损伤和保护机理作进一步的研究。冷冻干燥是指将制品在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，去除冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法，其过程可以分为三个阶段，预冻、一次干燥和二次干燥，而干燥过程占据了冷冻干燥过程的大部分能耗，存在干燥速率低、干燥时间长，因此采取有效措施选择合理的冻干曲线，优化冻干工艺提高干燥速率显得更有意义。

1 试验材料

1.1 试验用羊Orf毒液

85代羊Orf（HCE）毒液由“羊传染性脓疱皮炎(Orf)耐热性活疫苗的研究”项目组传代并增殖培养，TCID50 为 0.lml10-7.6。

1.2 试验用细胞

犊牛睾丸细胞由“羊传染性脓疱皮炎(Orf)耐热性活疫苗的研究”项目组制备。

1.3 试验仪器

真空冷冻干燥机：上海生产，甘肃省畜牧兽医研究所冻干苗车间提供

Mettler ToledoDL31水分测定仪：美国梅特勒-托利多公司生产CO2培养箱：日本Yamate公司生产高频火花真空测定器、高压蒸汽灭菌器、超净工作台、移液器、干燥箱、24孔细胞培养板等。

1.4 实验药品及试剂

1.4.1 羊Orf活疫苗耐热保护剂

由“羊传染性脓疱皮炎(Orf)耐热性活疫苗的研究”项目组自行研制。

1.4.2 化学试剂

199培养基、水解乳蛋白、碳酸氢钠、酚红等。

2 试验方法

通过对原始冻干曲线作适当调整（即预冻时间、冻干和干燥温度及时间的调整），采用羊Orf活疫苗耐热保护剂和调整后3种冻干曲线分别生产三批次羊Orf耐热性活疫苗，进行耐老化试验和物理性状观察与水分含量测定，优选出冻型良好、冻干时间较短的曲线做为羊Orf耐热性活疫苗的冻干曲线。

冻干曲线1：将活疫苗在10℃左右进箱，以每5分钟1℃的速度降至-40℃以下，维持2h，抽真空至1Pa后，然后将产品由-40℃以下温度升至-10℃，持续约14h，以每1h升温10℃，使产品温度升高到30℃时，维持3h后出箱，全程约28h左右。

冻干曲线2：将活疫苗在-5℃进箱，以每分钟0.3℃的速度降至-40℃以下，维持3h，抽真空至1Pa后，产品由-40℃以下升至-10℃，持续约14h，以每2h升温10℃，使产品温度升高到28℃时维持4h后出箱，全程约32h左右。

冻干曲线3：将活疫苗在常温下进箱，以每分钟0.5℃的速度降至-40℃或者以下，维持4h，抽真空至1.5Pa后，产品由-40℃以下升至-10℃，持续约16h，以每2h升温10℃，使产品温度升至25℃时维持6h出箱，全程约36h左右。

3 试验结果

试验结果

羊Orf耐热性活疫苗冻干曲线筛选试验结果（见表 4、表 5、图 6）

表4：物理性状、剩余水份测定结果

表5：冻干前、后病毒量损失及耐老化试验结果（ECID50测定结果）

图6：羊orf耐热性活疫苗的冻干曲线走势

由上述结果可以看出，采用三种不同的冻干曲线生产的三批羊Orf耐热性活疫苗，经物理性状观察与水分含量测定，差异不明显，结果均符合《中华人民共和国兽用生物制品制造及检验规程》，在耐老化试验中三批疫苗同样表现出了很好的耐热保护性能，虽然在冻干前后病毒损失量略有不同，但差异并不显著。因此，通过冻型好、冻干前后病毒损失量较小、冻干时间短，最终确定冻干曲线1为羊Orf耐热性活疫苗的最佳冻干曲线。

4 小结与讨论

生物制品的冷冻干燥技术其过程可分为三个阶段，即预冻、一次干燥和二次干燥，为防止产品在第一阶段升华时产品熔化，在预冻时，当板层达到设定温度后，需要维持一定的时间，其长短与产品的装量、容器及产品的共晶点有关。因此，羊Orf活疫苗(装量2 mL)在预冻时，应缓慢降温（约6h左右），当板层温度达到-54℃、维持时间约2h。预冻时间太短，产品没冻实，会在第一次干燥后期解冻、起泡和崩解，时间太长，延长冻干周期。

第一次干燥（升华阶段）就是从冻结制品中移走水分的过程，水分被移走后，就会留下所需的制品。冷冻干燥基本原理就是在低温的情况下，通过压力差所提供的动力把水分移走。由此可见冷阱的温度必须低于样品的温度，而真空泵的任务是尽可能地排除不凝集的气体。为了加快升华速度，缩短冻干时间，必须在第一阶段干燥时对制品进行加热，也就是通过增大二者压差来提速。羊Orf耐热性活疫苗在第一阶段干燥，箱压力应控制在0.12～0.20 mbar，维持时间约l4 h左右。在第一次干燥后，所有的冰已经消失，制品温度逐渐上升到加热设定的温度，但是制品并没有完全干燥，仍然会有7%以上的残余水分（结合水），因此水分含量还必须降低，使制品残余水分降到4%以下，此时需进行二次干燥 （解吸阶段），羊Orf耐热性活疫苗在第二次干燥阶段，要逐步加温，当板层温度达到30℃时应维持3 h左右，真空控制在0．15～0．22 mbar，出箱前结束。

优化冻干曲线有效地防止了制品理化及生物特性的改变，对生物组织和细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了许多热敏性生物制品有效成份的稳定性。生物制品经过冻干后水份含量非常低，使制品的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了制品保存期限。

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[4]刘宝全.兽医生物制品[M].北京:中国农业出版社,1995:89-92.

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S859.79+7

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1003-8655（2017）04-0016-02