橘皮提取液抑菌作用研究

路志芳 张超

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000）

·农产品加工·

橘皮提取液抑菌作用研究

路志芳 张超

（安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000）

本试验以柑橘副产品橘皮为原料，烘干后分别用无水乙醇和乙醚提取橘皮中活性成分，浓度分别稀释为1%、5%、9%、13%，用滤纸片法测定橘皮提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌的抑制作用，同时测定最低抑菌浓度和生长曲线。对比两种不同橘皮提取液的抑菌效果差异，分析橘皮提取液作为防腐剂的可行性。试验结果表明，在相同条件下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明显强于橘皮乙醚提取液，更适于做食品防腐剂。

橘皮；提取液；抑菌作用

橘皮，又称为陈皮，为芸香科植物橘及其栽培变种的成熟果皮。橘皮具有良好的抑菌作用，研究发现，柑橘皮渣对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、青霉、根霉、啤酒酵母等都有抑制作用。本试验在现有防腐剂基础上，研究了橘皮提取液提取方法及其抑菌作用，以满足企业生产技术的发展以及消费者对食品安全的需求。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为柑橘，食用级，市售；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌，安阳工学院生物与食品工程学院微生物实验室提供；无水乙醇，分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司提供；乙醚，分析纯，山东柠檬生化有限公司提供；牛肉膏，生化试剂，北京奥博星生物技术有限公司提供；蛋白胨，生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂提供；NaCL、琼脂粉，生化试剂，天津市致远化学试剂有限公司提供。试验设备为隔水式恒温培养箱，型号GHP-9050N，上海一恒科学仪器有限公司生产；数显恒温水浴锅，型号HH-4，北京中兴伟业仪器有限公司生产；电热恒温鼓风干燥箱，型号DGG-970B，上海森信实验仪器有限公司生产；高压灭菌锅，型号GT7C720，广州市番禹力丰食品机械厂生产；电子天平，型号JA21002，上海精天仪器有限公司生产；旋转蒸发仪，型号YRE-301，巩义市予华仪器有限责任公司生产；冰箱，型号BCD-230，青岛海尔股份有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 橘皮提取液对各指示菌种的敏感性测试

用接种环挑取少量活化菌种，置于灭菌后的生理盐水中，充分震荡混匀，制成菌悬液。取出经高压蒸汽灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基和培养皿。培养基冷却凝固前，在无菌操作台上迅速将培养基倒入培养皿内。培养基凝固后，用移液枪吸取菌悬液200μL注入平板，用平板涂布器均匀涂布。取充分蘸取各浓度橘皮提取液的滤纸片放入平板，每个培养皿中放3～5个，距离适中。37℃培养1d后，取其抑菌圈的平均直径，即为该提取液对此菌种的抑菌结果。

1.2.2 橘皮提取液对各指示菌种的最低抑菌浓度（MIC）［1］

观察并测量橘皮提取液对菌种敏感性测试的结果，顺浓度梯度查看，第一个起抑菌作用的橘皮提取液浓度即是此菌种最低抑菌浓度。确定不同溶剂橘皮提取液的最低抑菌浓度。

1.2.3 橘皮提取液对指示菌种生长的影响

选用橘皮乙醇提取液，用浓度为各指示菌的最低抑菌浓度1倍的浓度去作用3种指示菌种。通过比较各指示菌生长曲线的变化，观察各橘皮提取液对指示菌生长周期的影响。用大肠杆菌为例来加以说明，取20支经高压蒸汽灭菌的试管，每支试管分别倒入5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基，每管接种1mL大肠杆菌菌悬液。然后分成2组（每组10管），1组用来测定15h内大肠杆菌的的正常生长曲线，2组用来测定15h内加橘皮提取液后大肠杆菌的生长曲线。每隔1h取样测定其OD540值，绘制正常生长曲线和橘皮提取液作用后的生长曲线。

1.2.4 试验过程

（1）橘皮提取液提取：选取市售新鲜柑橘2kg，用清水洗净后剥去外皮，将剥下来的外皮放入电热恒温鼓风干燥箱干燥，干燥温度60℃、时间24h。干燥完毕后放于通风处1h，再用粉碎机充分粉碎，得到橘皮粉。将橘皮粉密封避光保存备用。称取20g橘皮粉放入2个500mL容量瓶中，容量瓶中分别加入200mL无水乙醇和乙醚，瓶上分别贴上标签，浸泡过夜。小心将容量瓶中的上部分液体倒出，用旋转蒸发仪减压回收溶剂，即得油状物。贴标签后放入冰箱4℃条件下密封避光保存。（2）培养基的制备：牛肉膏蛋白胨培养基配方为牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCL 5g、琼脂15～20g、水1000mL，pH值7.4～7.6。（3）培养基灭菌：将滤纸片放在需要灭菌的培养皿中，用报纸包裹培养皿，实验所需试管也用报纸包好，用绳扎紧。将放置培养基的三角瓶、实验所需培养皿、直径6mm的滤纸片和若干干净试管放入灭菌锅中灭菌，灭菌温度121℃、时间15min，灭菌完毕后取出待用。（4）菌悬液的制备：大肠杆菌1管，金黄色葡萄球菌1管，青霉菌1管。在无菌工作台上用接种环在酒精灯上烧烤后，打开菌种试管塞，从活化后的斜面菌种上刮少量菌，置于装有10mL无菌生理盐水的试管中，充分摇匀，最后贴上标签，备用。（5）橘皮提取液抑菌：在无菌工作台上，将还未冷却的培养基倒入培养皿中，每个约20mL。待培养皿内培养基冷却、凝固后，用移液枪准确量取200μL菌悬液放于固体培养基上，用涂布棒均匀涂布，置于37℃恒温箱中15min后取出，使得琼脂表面干燥，备用。用无菌镊子夹取灭菌的滤纸片，分别充分蘸取已稀释1%、5%、9%、13%的乙醇提取液和乙醚提取液，放在上述各含菌培养皿上。每种浓度的滤纸在培养皿内间隔一定的距离放3片。每个培养皿上都要贴上标签，标明溶剂类别和浓度。将培养皿倒置放入37℃恒温培养箱中，观察各菌种的生长情况，并测定最低抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 橘皮乙醇提取液的抑菌效果

由表1可知，橘皮乙醇提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果较明显，对青霉菌的抑菌效果不明显。提取液浓度达到5%时，橘皮乙醇提取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌开始起抑菌作用，提取液浓度达到13%时对青霉菌开始起抑菌作用。提取液浓度为9%时，对大肠杆菌表现出抑制作用；提取液浓度为13%时，对金黄色葡萄球菌起抑制作用。

表1 各浓度橘皮乙醇提取液的抑菌效果

2.2 橘皮乙醚提取液的抑菌效果

由表2可知，橘皮乙醚提取液对3种供试菌的抑制作用不明显，提取液浓度为9%时才对大肠杆菌起抑菌效果，浓度为13%时才对金黄色葡萄球菌起抑菌效果，而对青霉菌未表现出抑制作用。

表2 各浓度橘皮乙醚提取液的抑菌效果

2.3 最低抑菌浓度

由表1可知，本试验橘皮乙醇提取液浓度为5%时，大肠杆菌平板中开始有抑菌圈，5%乙醇橘皮提取液为大肠杆菌最低抑菌浓度；橘皮乙醇提取液浓度为5%时，金黄色葡萄球菌平板中开始有抑菌圈出现，5%乙醇橘皮提取液为金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度；橘皮乙醇提取液浓度为13%时，青霉菌平板中开始有抑菌圈出现，13%乙醇橘皮提取液为青霉菌最低抑菌浓度。由表2可知，本试验橘皮乙醚提取液浓度为9%时，大肠杆菌平板中开始有抑菌圈，9%乙醚橘皮提取液为大肠杆菌最低抑菌浓度；橘皮乙醚提取液浓度为13%时，金黄色葡萄球菌平板中开始有抑菌圈，13%乙醚橘皮提取液为金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度；而试验所测浓度范围内，橘皮乙醚提取液对青霉菌无抑菌效果。

2.4 橘皮乙醇提取液对菌种生长曲线的影响

以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉菌的正常生长曲线为对照，加入各菌种1倍最低抑菌浓度的橘皮乙醇提取液后，除青霉菌外，其它菌种生长曲线皆发生明显变化。柑橘皮提取液作用大肠杆菌7h后活菌数开始明显下降；12h后折线开始向下，进入衰亡期，没有达到正常的生长高峰。在柑橘皮提取物作用金黄色葡萄球菌6h或7h后，明显可以看到有活菌下降现象，11～12h后进入衰亡期。这些数据表明，柑橘皮提取液主要抑制了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在对数生长期的菌体分裂。

3 小结

两种有机溶剂提取液相同浓度相同菌种抑菌效果对比下，橘皮乙醇提取液抑菌效果明显强于乙醚提取液。不同浓度的橘皮提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定抑制效果，抑制效果与浓度成正相关。试验范围内，各浓度橘皮提取液对青霉菌基本没有效果。大肠杆菌的最低抑菌浓度最低，说明该指示菌对橘皮提取液最敏感。从试验结果来看，橘皮提取液具有一定抑菌效果。由于我国柑橘资源丰富，廉价易得，从天然防腐剂取代人工防腐剂趋势来看，柑橘具有较好的利用价值。从植物中提取天然防腐剂是现代食品防腐剂发展的新方向，是消费者对天然防腐剂的需求，具有很高的研究价值和开发前景。且柑橘中各物质的提取工艺相对简单，具有橙香气，根据其对微生物的抑制作用，可制成新型的食品防腐剂。

［1］陈涛.芦荟与常见食品防腐剂的抑菌效果比较［J］.山西化工，2009，29（5）：20～22.