添食氟化物后雌雄家蚕中肠和头部氟离子的吸收累积规律

米 智 刘荔贞 徐 水 朱 勇

(1. 西南大学生物技术学院，重庆 400716；2. 山西大同大学生命科学学院，大同 037009；3. 山西大同大学化学与环境工程学院，大同 037009)

添食氟化物后雌雄家蚕中肠和头部氟离子的吸收累积规律

米 智1,2刘荔贞3徐 水1朱 勇1

(1. 西南大学生物技术学院，重庆 400716；2. 山西大同大学生命科学学院，大同 037009；3. 山西大同大学化学与环境工程学院，大同 037009)

为了探讨氟离子在雌雄家蚕中肠和头部的吸收累积情况，以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为研究材料，按照常规方法饲养到5龄起蚕时，对2品种家蚕进行雌雄鉴别，并将其分区饲养。添氟组喂食经200mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶，另设清水对照组，检测不同性别家蚕中肠和头部氟离子浓度的积累情况。结果表明，在中肠中，对照组734和T6雄蚕氟离子浓度分别高雌蚕1.20倍和1.03倍，添氟组734和T6雄蚕均是雌蚕的1.05倍。734雄蚕添氟组是对照组的1.67倍，而雌蚕添氟组是对照组的1.58倍。T6雄蚕添氟组是对照组的1.22倍，而雌蚕添氟组是对照组的1.20倍。在头部，对照组734和T6雄蚕分别是雌蚕1.39倍和1.08倍，添氟组734和T6雄蚕分别约是雌蚕的1.10倍和1.03。734雄蚕添氟组是对照组的1.10倍，而雌蚕添氟组是对照组的1.39倍。T6雄蚕添氟组是对照组的1.10倍，而雌蚕添氟组是对照组的1.03倍。两种组织中，均表现出雄蚕中的氟离子浓度高于雌蚕的。

家蚕；氟化物；头；中肠；氟离子

近年来随着工农业的发展,陶瓷、砖瓦、磷肥、炼铝、水泥、玻璃、火力发电等部门排放的废气中含有大量氟化物，给蚕桑生产带来较大的危害。氟化物是一类原生质毒剂，易透过各种组织的细胞壁与原生质结合产生毒性效应[1,2]。研究表明，氟化物随桑叶进入蚕体累积于消化液、肠壁和体壁等处，通过消化管进入血液，在血液和组织中与蛋白质结合，抑制生长发育，出现氟中毒症状[3]。雌雄家蚕对氟的耐受性因品种而异，但很多品种均表现出雄蚕耐氟性能强于雌蚕，从统计学角度看雌雄家蚕耐氟性能有差异但尚未达到显著水平[4]。

氟离子测定方法常用的有氟离子选择电极法、高温灰化—碱融法、湿灰化—气体吸收法等[5,6]。其中氟离子电极法，具有简便、快捷、准确等优点，完全可以应用于多样品实验中的氟离子含量测定。其余方法程序复杂，测定成本高，所需时间长。对于蚕桑业中氟化物污染程度的鉴定，要求快速、便捷、准确，氟离子选择电极法更为适合。

氟离子选择电极检测方法采用标准曲线法[7,8]：即置电极于一系列的标准液中，测定标准液的电极电位。标准液的范围应包括预计样品溶液的浓度，然后测量样品溶液的电极电位。在对半数坐标纸上绘制标准曲线，标准溶液的浓度对数值(横坐标)与相应的电极电位(纵坐标)。通过标准曲线的方程，求得样品溶液的氟离子浓度。用标准曲线法测定时，测定液的pH值应在5-6左右，因为氟离子选择电极一般以pH在5-6之间测定值较为准确。

本实验在已知雌雄家蚕耐氟性的前提下，检测不同组织中氟离子浓度，以期阐明氟离子在不同性别不同组织中的累积情况。

1 材料与试剂

1.1实验材料

家蚕耐氟品种T6、敏感品种734，由中国农业科学院蚕业研究所提供，西南大学家蚕遗传育种室保存。按照常规方法饲养到5龄起蚕时，对家蚕进行雌雄分别，并分区饲养。对照组喂食清水浸泡11min后自然晾干的新鲜桑叶，试验组用200mg/kg NaF溶液浸泡11 min后自然晾干的桑叶饲养[9]，每隔8h添食1次，每天添食3次。试验采用平行设计，每组设3个重复。从5龄起蚕第1-5d每天分别在冰盘上取各组幼虫的组织样品。

1.2样品处理

(1)将蚕体置于冰盘上解剖，小心取出中肠，去掉中肠的内容物，用0.9%生理盐水冲洗干净。

(2)取10头家蚕中肠，加入5mL 0.04M pH7.0的PBS进行匀浆，取1mL作为测试样品。

(3)小心用灭菌后的剪刀剪取家蚕头部组织，加入质量9倍体积的9g/L NaCl溶液，制成10%的匀浆，3 500rpm离心10min，取上清0.5mL用作测试样品。

(4)将测试样品置于50mL容量瓶中，加10mL盐酸(1+11)，密闭浸泡提取1h(不时轻轻摇动)，应量避免样品粘于瓶壁上。提取后加25mL总离子强度缓冲剂，加水至刻度，混匀，测定。

1.3试剂和药品

本实验所用水均为超纯水，试剂全部贮于聚乙烯塑料瓶中。氟化钠(NaF)需经95-105℃干燥4h后冷却(至恒重)使用。浓盐酸(HCl)、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)、柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)、乙酸(CH3COOH)、氢氧化钠(NaOH)、高氯酸(HClO4)、氯化钠(NaCl)均由科隆化工有限公司。

1.4仪器与设备

PHS-3C型精密酸度计(成都世纪方舟科技有限公司)，PF-1型氟离子选择性电极(上海精密科学仪器有限公司)，雷磁232型参比电极(上海雷磁仪器厂)，78-1型磁力加热搅拌器(金坛市富华仪器有限公司)，纯水仪(德国millipor-DQ3)。

1.5试剂配制

(1)1mol/L盐酸：取10mL浓盐酸，超纯水稀释，定容至120mL。

(2)1mol/L乙酸：准确量取57.23mL冰乙酸，超纯水稀释，定容至1 000mL。

(3)3mol/L乙酸钠溶液：称取204g乙酸钠(CH3COONa·3H2O)溶于300mL水中，加1mol/L乙酸，调节pH至7.0，超纯水稀释，定容至500mL。

(4)0.75mol/L柠檬酸钠溶液：称取110g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶于300mL水中，加14mL高氯酸，再加水稀释，定容至500mL。

(5)总离子强度缓冲剂：3mol/L乙酸钠溶液与0.75mol/L柠檬酸钠溶液等量混合，现配现用。

(6)氟标准溶液：准确称取0.22g氟化钠，溶于水，移入100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。

(7)氟标准使用液：吸取10.0mL氟标准溶液置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。如此反复稀释此溶液至氟离子浓度为1.0μg/mL。

2 实验方法

2.1绘制氟离子标准曲线

(1)接通酸度计电源，预热20min。

(2)将酸度计按键选择置“mv”位置，此时仪器显示应为0.00。

(3)取下饱和甘汞电极下端和上端小胶帽.检查电极内液位、晶体气泡及多孔型物质的渗漏情况。

(4)若都合格，则用蒸馏水清洗电极外部，用滤纸吸干外壁水分，若不合格，则加入饱和的KCl，以满足电极需要。

(5)取出已在10-3mol/L的NaF溶液中浸泡活化2h以上的氟离子电极。

(6)检查电极晶片内侧是否有气泡。若有，应让电极下端晶片朝上，轻击电极杆以赶出气泡。

(7)将饱和甘汞电极和氟离子电极分别置于电极夹上，并接入仪器。

狐假虎威——The Fox Who Profited by the Tiger’s Might瞎子问太阳——-What the Sun Look Like?神像和好人——A Good Man iseasy to Bully.

(8)取6个洁净的50mL容量瓶，分别加入10μg/mL氟标准液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，并在各容量瓶中分别加入总离子强度调节缓冲剂25mL和1mol/L盐酸10mL，用蒸馏水稀释至标线后混匀，并依次由1到6编号。

(9)取一洁净的50mL小烧杯，装上40mL蒸馏水并放在电磁搅拌器托座上，插入两电极。开启电磁搅拌器，调节电磁搅拌器转速。

(10)观察仪器上的电位值，若数值接近370mv，说明氟电极已清洗好；如果相差甚远，应重换蒸馏水，再洗直至显示值与370mv电位值相近。

(11)取6个洁净的小烧杯贴上标签编号，在6个小烧杯中分别用所配制的标准溶液荡洗三次后，再倒入相应的标准溶液。

(12)用蒸馏水清洗干净电极后，插入盛有含氟为0.0μg/mL的1号溶液的烧杯中，并调节电磁搅拌器转速与9相同，待仪器上数字显示稳定后，停止搅拌，读取电位值，并记录。

(13)用超纯水清洗电极，直至显示值与氟电极空白电位值相近。

(14)依次由低浓度到高浓度分别测定各溶液的电位值，并记录。注意，每次测完都要用超纯水清洗电极，直至原空白电位值。

2.2样品测定与分析

3 结果与分析

3.1氟离子浓度标准曲线

根据已知氟离子浓度的检测结果，纵坐标为“MV”的绝对值，横坐标为氟离子浓度对数值，绘制标准曲线。得到回归方程式y=33.53x+238，相关系数R2=0.998。

3.2不同组织中氟离子浓度变化

3.2.1 雌雄家蚕中肠中氟离子浓度变化

从图2、3可以看到：734雌蚕对照组中肠氟离子浓度在前4d呈上升趋势，且在第4d达最大值，第5d氟离子浓度下降；雄蚕对照组前3d呈先降后升的变化趋势，之后同雌蚕的变化趋势；雌蚕20mg/kg NaF处理组前3d呈平缓直线型下降，之后同对照组变化趋势；雄蚕200mg/kg NaF处理组变化规律同雌蚕对照组变化相似。734雄蚕对照组在整个试验期氟离子的平均浓度均高于雌蚕，约为雌蚕的1.20倍；200mg/kg NaF处理组的雄蚕中肠氟离子浓度约是雌蚕的1.05倍。雄蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.67倍，而雌蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.58倍。

图1 氟离子浓度标准曲线

图注：CK ♀表示对照组雌蚕，CK ♂表示对照组雄蚕，F ♀表示添氟200mg/kg的雌蚕，F ♂表示添氟200 mg/kg的雄蚕。

图2 5龄家蚕734幼虫添食NaF后中肠氟离子浓度变化

图注：CK ♀表示对照组雌蚕，CK ♂表示对照组雄蚕，F ♀表示添氟200mg/kg的雌蚕，F ♂表示添氟200 mg/kg的雄蚕。

图3 5龄家蚕T6幼虫添食NaF后中肠氟离子浓度变化

T6品种中不管是雌蚕还是雄蚕，对照组与200mg/kg NaF处理组的变化规律基本一致，在前3d呈下降趋势，在第4d上升达最大值，第5d呈下降；T6雄蚕对照组氟离子浓度在整个试验期均高于雌蚕，平均浓度约为雌蚕的1.03倍；200mg/kg NaF处理组的雄蚕中肠氟离子浓度约是雌蚕的1.05倍。雄蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.22倍，而雌蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.20倍。不管是氟化物敏感品种734还是耐氟品种T6，不管是添氟处理组还是对照组，均为雄蚕中肠氟离子浓度大于雌蚕的，氟离子浓度随着添氟浓度增加而增加。

3.2.2 雌雄家蚕头部组织氟离子浓度变化

从图4、5可以看到：734品种中不管是雌蚕还是雄蚕，对照组与200mg/kg NaF处理组的变化规律基本一致，在前3d呈先降后升的趋势，在第4d上升达最大值，第5d呈下降。前3d和第5d，不管是雌蚕还是雄蚕，200mg/kg NaF处理组的头部组织氟离子浓度均高于对照组，在第4d却是雄蚕头部对照组大于200mg/kg NaF处理组大于雌蚕200mg/kg NaF处理组大于雌蚕对照组。雄蚕在整个试验期对照组氟离子的平均浓度均高于雌蚕，约为雌蚕的1.39倍；200mg/kg NaF处理组的雄蚕头部氟离子浓度约是雌蚕的1.10倍。雄蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.10倍，而雌蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.39倍。

图注：CK ♀表示对照组雌蚕，CK ♂表示对照组雄蚕，F ♀表示添氟200mg/kg的雌蚕，F ♂表示添氟200 mg/kg的雄蚕。

图4 5龄家蚕734幼虫添食NaF后头部氟离子浓度变化

图注：CK ♀表示对照组雌蚕，CK ♂表示对照组雄蚕，F ♀表示添氟200mg/kg的雌蚕，F ♂表示添氟200 mg/kg的雄蚕。

图5 5龄家蚕T6幼虫添食NaF后头部氟离子浓度变化

T6除200mg/kg NaF处理组的雄蚕在前3d呈先升后降的变化趋势，其余处理组呈先降后升的趋势，在第4d上升且达最大值，在第5d下降，T6对照组和添氟组头部组织在整个试验期没有规律可循，第4d对照组的氟离子浓度高于添氟组，而在第5d添氟组氟离子浓度又高于对照组。雄蚕对照组在整个试验期氟离子的平均浓度均高于雌蚕，约为雌蚕的1.08倍；200mg/kg NaF处理组的雄蚕头部氟离子浓度约是雌蚕的1.03倍。雄蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.10倍，而雌蚕200mg/kg NaF处理组是对照组的1.03倍。

4 小结与讨论

雌雄个体由于体内某些生理生化特性的差异，导致昆虫对外界不良环境的抵抗能力产生性别间的差异。对不同家蚕品种添食NaF，检测5d内不同浓度NaF处理后中肠和头部组织中氟离子浓度。不管是雌蚕还是雄蚕，不管是氟化物敏感品种734还是耐氟品种T6，中肠组织随着添氟浓度的增加，其氟离子浓度在增加，而头部组织5d内的平均浓度也是在增加，但与中肠组织有差异，在整个试验期，中肠组织中任意一天均表现为添氟组的氟离子浓度高于对照组，而在头部组织中却不一致，有时添氟组的氟离子浓度高于对照组，有时对照组的氟离子浓度高于添氟组。

734、T6不同性别家蚕添食氟化物后，检测其头部和中肠中氟离子浓度，均表现出雄蚕中的氟离子浓度大于雌蚕的。同品种不同性别不同浓度之间的氟离子浓度差异分析，在头部组织中，添食200mg/kg NaF的734雌蚕约是对照组的1.39倍，雄蚕约是1.10倍，T6雌蚕约是对照组的1.03倍，雄蚕约是对照组的1.10倍。由此可见，添氟处理后与对照组相比，734雌蚕头部累积的相对氟离子浓度高于雄蚕，而T6雄蚕头部累积的相对氟离子浓度高于雌蚕，说明不同家蚕品种在头部组织中氟离子浓度累积与雌雄差异有关。在中肠中，添食200mg/kg NaF的734雌蚕约是对照组的1.58倍，雄蚕约是1.67倍，T6雌蚕约是对照组的1.20倍，雄蚕约是1.22倍。与对照组相比，734、T6雄蚕累积的氟离子浓度高于雌蚕，而734氟离子浓度在雌雄之间的差异大于T6。同品种不同性别同浓度之间的氟离子浓度分析，在头部组织中，734对照组雄蚕约是雌蚕的1.39倍，添氟组雄蚕约是雌蚕的1.10倍，而T6对照组雄蚕约是雌蚕的1.08倍，添氟组雄蚕约是雌蚕的1.03倍。在中肠中，734对照组雄蚕约是雌蚕的1.20倍，添氟组雄蚕约是雌蚕的1.05倍，而T6对照组雄蚕约是雌蚕的1.03倍，添氟组雄蚕约是雌蚕的1.05倍。从上述数据来看，734不同性别家蚕各组织中氟离子浓度受氟化物影响明显大于T6，且734对照组中雌雄家蚕氟离子浓度差异大于添氟组。

前人研究证明，同一品种雌雄蚕之间有一定的差异，即雄蚕(素蚕)有较雌蚕(花蚕)强的趋势[10]。从本实验数据来看，同品种同浓度NaF处理后家蚕雄蚕组织中氟离子平均浓度高于雌蚕组织，推测家蚕雌雄性个体中的某些基因或者蛋白，尤其一些解毒酶类或代谢酶类，与氟离子作用的差异较大，致使雌雄个体表现出不同的耐氟性。

[1] ANURADHA C D, KANNO S, HIRANO S. Oxidative damage tomitiochondria is a preliminary step to caspase-3 activation influoride-induced apoptosis in H+-60 cell[J]. Free Radic Biol Med, 2001, 31(3):367-373.

[2] ZHANG M, WANG A G, HE W H, et al.Effects of fluoride on the expression of NCAM, oxidative stress, and apoptosis in primary cultured hippocampal neurons[J]. Toxicology, 2007, 236:208-216.

[3] 黄君霆,朱万民,夏建国,等.中国蚕丝大全[M].成都:四川科学技术出版社，1996:462-467.

[4] 李傲祥, 朱勇, 张高军, 等. 家蚕耐氟性遗传育种研究进展[J]. 蚕学通讯, 2007,27(4):30-34.

[5] 屈德明,于淮堂,刘友丽.蚕桑氟污染灾害及其防减灾对策探讨[J].江苏蚕业, 1999.3:38-39.

[6] 刘超,吴方正.茶叶中的氟含量及测定方法研究[J].农业环境保护,1998.17(3): 132-135.

[7] GB8372-2008,中华人民共和国国家标准(牙膏)[S].

[8] 刘源,叶平,边建朝.酸解消化扩散法用于牛血清氟标准物总氟的测定[J].地方病通报,2002, 17(1):15-16.

[9] 黄玲莉,韦博尤,蒙艺英.氟化钠溶液浸泡时间对桑叶含氟浓度变化的试验[J].广西蚕业,2005.42(004):5-7.

[10]唐顺明,沈兴家,李奕仁,等. 家蚕雌雄性别耐氟性能差异的初步研究[J]. 中国蚕业,2000,84(4):16-17.

AbsorptionandAccumulationofFluorineIoninMidgutandHeadofFemaleandMaleBombyxmoriAfterFeedingwithFluoride

MI Zhi1,2LIU Li-zhen3XU Shui1ZHU Yong1

(1.CollegeofBiotechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China；2.CollegeofLifeScience,ShanxiDaTongUniversity,Datong,Shanxi037009,China；3.CollegeofChemistry&EnvironmentalEngineering，ShanxiDaTongUniversity，Datong,Shanxi037009,China)

We explored the absorption and accumulation of fluorine ion in the head and the midgut of silkworm (Bombyxmori), using the fluoride-resistant silkworm strain T6 and the fluoride-sensitive strain 734 as the experiment materials. The two silkworm strains were sex discriminated. From the first day of the fifth instar, the silkworm larvae were fed with mulberry leaves soaked in 0 and 200 mg/kg NaF solutions, respectively. Then we examined the fluorine ion concentration in their head and midgut. Results showed that in the midgut, fluorine ion concentration of the control groups of 734 and T6 male silkworm was 1.20 and 1.03 times higher than that of the female silkworm, respectively, and in the NaF-treatment groups of both strains, fluorine ion concentration of the male was 1.05 times higher than that of the female. The fluorine ion concentration of the NaF-treatment 734 male and female silkworm was 1.67 and 1.58 times higher than that of the control group, respectively. The fluorine ion concentration of the NaF-treatment T6 male and female silkworm was 1.22 and 1.20 times higher than that of their respective control groups. In the head, the fluorine ion concentration of the male silkworm of 734 and T6 was 1.39 and 1.08 times higher than that of the female silkworm in the control groups, respectively, and 1.10 and 1.03 times higher than the female in the NaF-treatment group. The fluorine ion concentration of the NaF-treated T6 male and female silkworm was 1.10 and 1.03 times, respectively, higher than that of the control group. In short, the male silkworm had higher fluorine ion concentration in both tissues than the female silkworm.

Bombyxmori; fluoride; head; midgut; fluorine ion

重庆市“十百千万”优质蚕茧工程公共项目，高抗氟性家蚕新品种“渝蚕2号”的推广与示范，山西大同大学博士科研启动项目。

米智，男，山西，博士，讲师，主要从事家蚕遗传育种研究。E-mail:mizhi775@126.com

朱勇，教授，博士生导师。Tel：023-68251939，E-mail:zhuy@swu.edu.cn