不同海拔粗茎秦艽环烯醚萜苷类成分含量研究

张晓灿，段宝忠，罗丹丹，陶爱恩，李杨

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

不同海拔粗茎秦艽环烯醚萜苷类成分含量研究

张晓灿，段宝忠，罗丹丹，陶爱恩，李杨*

（大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的：探讨不同海拔粗茎秦艽中环烯醚萜苷类成分，为粗茎秦艽人工种植及仿野生栽培基地选择提供依据。方法：采用高效液相色谱法测定不同海拔粗茎秦艽中4种活性成分的含量，同时结合化学计量学方法对其指纹图谱进行分析。结果：26批药材含量均符合《中国药典》质量规定，指纹图谱相似度均大于0.9，随海拔升高4种活性成分总含量呈钟状变化。结论：海拔2 700 m左右地区的粗茎秦艽药材质量较优，建议粗茎秦艽人工种植及仿野生栽培基地选择此海拔附近。

粗茎秦艽；海拔；环烯醚萜苷类成分

粗茎秦艽为龙胆科植物粗茎秦艽Gentiana crassicaulisDuthie ex Burk.干燥的根，具有祛风湿，清湿热，止痹痛，退虚热的功效〔1〕。其活性成分主要是环烯醚萜苷类，包括马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷等〔2〕。粗茎秦艽野生资源严重枯竭，被列为国家三级重点保护的野生药材。药材的生长及品质与生态因子密切相关，已有学者研究了秦艽化学成分的积累与气候因子具有显著的相关性〔3〕。有关粗茎秦艽的研究方面，相关学者对其主要有效成分进行了测定〔4-7〕、同时对其品质与栽培土壤化学因子的相关性分析〔8〕等进行了研究，但生态因子对粗茎秦艽中活性成分影响的相关研究尚未见报道。鉴于此，本实验采用HPLC法对云南省兰坪县不同海拔地区粗茎秦艽中4种环烯醚萜苷类成分进行了定量分析，并对其与海拔的相关性进行了探讨，以期为粗茎秦艽规范化种植中基地选择提供参考。

1 材料

1.1 材料与试剂Agilent 1200高效液相色谱仪，包括：G1322A在线脱气机、G1311A四元梯度泵、G1329A进样器、G1316A柱温箱、G1314B VWD检测器和ChemStation色谱工作站（美国Agilent公司）。Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），GH-252电子天平（日本AND）、SB25-12D超声波清洗机（功率500 W，频率60 kHz，宁波新芝生物科技股份有限公司），AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。色谱级甲醇、乙腈（Fisher Scientific，Fairlawn New Jersey），水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 试药对照品马钱苷酸（批号：MUST-11042501）、獐牙菜苦苷（批号：MUST-11012401）、龙胆苦苷（批号：MUST-11011401）和獐牙菜苷（批号：MUST-11020802）均购于成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%。

1.3 实验样品粗茎秦艽为兰坪恒通农业开发有限公司野生抚育种植在山地上的4年生药材，2016年1月23日至25日采于云南省兰坪县4个村。见表1。经段宝忠副教授鉴定为粗茎秦艽G.crassicaulisDuthie ex Burk.的干燥根，标本存放于大理大学药学与化学学院标本馆。

表1 样品信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件、对照品溶液的制备及标准曲线和线性考察参见文献〔5〕进行。

2.2 供试品溶液的制备取本品粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加水15 mL，超声处理（功率200 W，频率40 kHz）60 min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1精密度试验取同一供试品溶液（S5），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，12个共有峰峰面积的RSD＜0.97%，表明仪器精密度良好。

2.3.2重复性试验取同一样品（S5）6份，按“2.2”项下方法制备，进样测定。计算4个环烯醚萜苷类成分含量，其RSD＜1.26%，表明该实验方法重复性良好。

2.3.3稳定性试验取同一份供试品溶液（S5），分别在0，4，8，12，18，24，48 h进行测定，计算含量，RSD均＜1.36%，说明各对照品溶液在48 h内稳定。

2.3.4加样回收率实验取已知含量的同一份粗茎秦艽药材细粉，精密称定6份，分别精密加入一定量的对照品，按“2.2”项下方法制备，进样测定，计算回收率，平均回收率在99.77%～100.66%，RSD≤1.48%。

2.4 样品含量测定取26批粗茎秦艽样品，按“2.2”项下方法制备，平行操作3次，按外标法计算4种环烯醚萜苷类成分的含量，HPLC图谱见图1，含量测定结果见表2。从表2中可看出，8～17号样品（海拔2 707～2 750 m）中4种环烯醚萜苷类成分的总含量在92～117 mg∕g之间，其余海拔批次样品总含量均低于90 mg∕g。

图1 样品（A）及对照品（B）HPLC图谱

表2 不同海拔粗茎秦艽中马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷的含量

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1指纹图谱的建立及相似度评价将26批粗茎秦艽药材HPLC图谱导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2.0版）软件，以S1批次药材图谱为参照谱进行指纹匹配，确定了12个共有峰，其中4个色谱峰通过对照品保留时间确认，分别为马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、獐牙菜苷。粗茎秦艽特征指纹图谱的共有模式图谱见图2（R），26批样品相似度结果见表3，结果显示，样品相似度均大于0.9，表明各批次样品质量均一。

图2 26批粗茎秦艽样品HPLC图谱

表3 26批粗茎秦艽药材的相似度

2.5.2主成分分析运用SPSS 17.0对26批药材化学共指纹图谱进行主成分分析，相关系数矩阵结果见表4。结果表明，獐芽菜苦苷与龙胆苦苷具有较大的正相关性；马钱苷酸与獐芽菜苦苷、龙胆苦苷均有较大正相关性；4种化学成分与海拔无显著相关性。将不同粗茎秦艽成分含量标准化数据与相应主成分得分系数的乘积相加得到粗茎秦艽含量的主成分得分，得分图见图3。从图3中可看出，11号样品得分最高，9、13、14号样品次之，其中8～17号样品的得分均较高，其海拔范围集中在2 700～2 750 m之间。主成分分析的得分情况反映了不同产地粗茎秦艽的药材质量，得分越高，表明粗茎秦艽的质量越好。相对于其他海拔地区的样品，2 700 m左右地区的粗茎秦艽药材质量较优。

表4 相关性矩阵

图3 26批粗茎秦艽样品主成分分析得分图

3 讨论

本实验采用HPLC法，建立了粗茎秦艽药材HPLC图谱及其共有模式图谱，并对其有效成分马钱苷酸、獐牙菜苦苷、龙胆苦苷和獐牙菜苷的含量进行了测定。从结果可见，粗茎秦艽中4种环烯醚萜苷类成分的含量变化存在差异，其中以龙胆苦苷的含量最高，马钱苷酸次之，獐牙菜苦苷和獐牙菜苷的含量均较低。26批药材含量测定结果显示均符合《中国药典》质量规定，指纹图谱相似度均大于0.9，表明药材质量较均一。4种活性成分的总含量随海拔升高呈钟状变化。海拔2 700 m左右地区的粗茎秦艽有效成分含量明显高于其他区域，实验结果对粗茎秦艽人工种植及仿野生栽培基地选择提供了科学参考。云南西北部地区兰坪县、剑川县、维西县等地海拔2 700 m左右，有大面积的荒地、轮歇地，这些地区不适宜其他农作物的生长，而恰是粗茎秦艽等中药材的适生区域。在这些地区发展粗茎秦艽等中药材的野生抚育种植，对促进当地社会经济发展，推动山区群众脱贫致富具有重要的现实意义。

〔1〕国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2015：270.

〔2〕曹晓燕，王喆之.云南粗茎秦艽不同采收期4种环烯醚萜苷类成分的测定〔J〕.药物分析杂志，2010（4）：623-625.

〔3〕李金花，曾锐，李文涛，等.秦艽品质与气候因子相关性分析〔J〕.世界中医药，2016，11（5）：801-806.

〔4〕吴靳荣，赵志礼，王妍妍，等.云南丽江产粗茎秦艽栽培品种的品质评价〔J〕.中成药，2010，32（2）：250-252.

〔5〕段宝忠，黄林芳，尚飞能，等.云南野生抚育粗茎秦艽药材的品质评价〔J〕.中国实验方剂学杂志，2013，19（21）：82-86.

〔6〕宋九华，杨文钰，孟杰，等.HPLC波长切换法同时测定粗茎秦艽中6个成分的含量〔J〕.化学研究与应用，2014，26（7）：1136-1140.

〔7〕张晓灿，李杨，罗丹丹，等.基于指纹图谱和化学计量学的多基原秦艽药材化学品质比较研究〔J〕.大理大学学报，2017，2（6）：37-40.

〔8〕宋九华，孟杰，曾羽，等.粗茎秦艽根茎品质与栽培土壤化学因子的相关性分析〔J〕.植物资源与环境学报，2014，23（4）：75-82.

Effect of Different Altitudes on the Content of Iridoid Glycoside in Gentiana crassicaulis

Zhang Xiaocan,Duan Baozhong,Luo Dandan,Tao Aien,Li Yang*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To observe the content of iridoid glycoside inGentiana crassicaulsgrowing at different altitudes and to provide a scientific basis for the cultivation of this herb and its suitable planting areas.Methods：A HPLC method was used to measure the content of four active components inGentiana crassicaulsat different altitudes,and chemometric methods were applied to analyze HPLC fingerprinting and chemical recognition.Results：The content of the active components in this medical plant from 26 product batches was in compliance with relevant standards of quality.The similarity of chromatographic fingerprints was greater than 0.9.The experimental results indicated that the influence of altitude variations on the content of iridoid glycoside was not significant.Conclusion：The iridoid glycoside content in theGentiana crassicaulsroots at the altitude of 2 700 m is higher than that at other altitudes which is suitable for the cultivation ofGentiana crassicauls.

Gentiana crassicauls;altitudes;iridoid glycoside

R284.2

A

2096-2266（2017）08-0013-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.004

（责任编辑 李杨）

云南省中青年学术技术带头人后备人才项目（2015HB058）；云南省基础研究计划资助项目（2016FD073）

2016-12-08

2017-03-21

张晓灿，硕士研究生，主要从事中药资源与鉴定研究.

*通信作者：李杨，编辑.