Necrostatin-1对输尿管梗阻小鼠肾脏炎症的影响

肖 夏，张 涛，杨昕达，滕 晴，侯 佳，任韫卓

Necrostatin-1对输尿管梗阻小鼠肾脏炎症的影响

肖 夏1，张 涛2，杨昕达1，滕 晴1，侯 佳1，任韫卓1

目的 探讨necroptosis(坏死性凋亡)抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对单侧输尿管梗阻(unilateral ureter obstruction, UUO)小鼠肾脏炎症的影响。方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、左侧输尿管结扎组(UUO组)、UUO+Nec-1治疗组(UN组)，术后7天处死小鼠取左肾。收集血清测定肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；HE染色观察肾脏形态学改变；免疫组化法和Western blot法分别检测肾脏组织中坏死性凋亡相关指标RIP1、RIP3、MLKL以及炎症相关因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达。结果 与Sham组相比，UUO组小鼠RIP1、RIP3和MLKL蛋白表达明显升高，同时伴有TNF-α、IL-1β、MCP-1表达增多。Nec-1治疗显著降低了上述蛋白的表达水平，同时HE染色显示肾间质炎性反应和肾小管损伤程度有所减轻，Scr和BUN水平提示肾功能有所改善。结论 Nec-1通过抑制necroptosis减轻了单侧输尿管梗阻小鼠肾脏的炎症反应，这可能成为治疗肾脏继发炎症的新靶点。

炎症；输尿管梗阻；Necrostatin-1；necroptosis

肾间质的炎症反应是多种肾脏疾病发生、发展的病理生理基础，在输尿管梗阻和其他疾病导致的进行性肾间质纤维化中发挥重要的促进作用。有效抑制炎症反应，对疾病的预后有重要意义。炎症反应的发生机制和多种因素有关，其中坏死被认为是引起炎症的主要因子。necroptosis[1]通常被译作“坏死性凋亡”，是一种非caspase依赖的可调控的细胞程序性坏死途径。新近研究发现，necroptosis能够诱发炎症反应，促使组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1等多种炎症因子表达上调[2]，并与多种肾脏损伤性疾病密切相关。而necroptosis在单侧输尿管梗阻导致的肾间质炎症反应中发挥怎样的作用，尚未见报道。Necrostatin-1(Nec-1)是necroptosis的特异性阻断剂，通过作用于necroptosis的特异性分子标志物RIP1和RIP3的激酶活性部位，抑制其相互磷酸化从而抑制necroptosis[1-3]。本实验通过建立经典的单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型，给予Nec-1治疗，观察necroptosis在肾脏炎症反应中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 Nec-1购自MedChem Express公司，兔多克隆抗体RIP1、RIP3、MLKL、MCP-1、IL-1β购自Abcam公司，兔多克隆抗体TNF-α购自Novusbio公司。SP三步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。RIPA裂解液购自上海贝博生物公司。BCA试剂盒购自Solarbio公司。血肌酐(Scr)测定试剂盒、尿素氮(BUN)测定试剂盒购自中生北控生物公司。

1.2 动物模型 12只雄性C57BL/6J小鼠，质量约25 g。按随机区间法分为假手术组(Sham组，n=4)、左侧输尿管结扎组(UUO组，n=4)、UUO+Nec-1治疗组(UN组，n=4)。UUO组和UN组在无菌条件下行左侧输尿管结扎术，完全梗阻左肾，Sham组除不结扎输尿管外同模型组做相同处理。UN组自手术日起，每天给予Nec-1 150 μL(0.1 μg/μL)腹腔注射治疗。术后第7天腹腔麻醉后切除左肾，留取肾门处横断面的肾组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成3 μm厚石蜡切片用于病理染色，剩余肾组织迅速置液氮后-80 ℃保存。

1.3 HE染色 石蜡切片行常规HE染色，观察3组肾组织的病变情况。

1.4 肾功能测定 采用RT-9600半自动生化分析仪(美国雷杜)测定Scr和BUN水平。

1.5 免疫组化 3 μm厚石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2甲醇封闭20 min，高压修复，山羊血清37 ℃封闭30 min，一抗RIP1(1 ∶400)、RIP3(1 ∶1 000)、MLKL(1 ∶400)4 ℃过夜，后二抗、三抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树脂封固。每组均以PBS代替一抗作阴性对照。

1.6 Western blot法 用RIPA裂解液提取肾皮质总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，50 μg每孔上样，10%～12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳90～120 min后转膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，一抗RIP1(1 ∶400)、RIP3(1 ∶1 000)、MLKL(1 ∶500)、MCP-1(1 ∶1 000)、IL-1β(1 ∶2 000)、TNF-α(1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜，β-actin(1 ∶2 000)作为内参照，二抗(1 ∶5 000)37 ℃孵育1 h。采用ODYSSEY远红外双色荧光成像系统显影，Image J图像分析软件分析电泳条带灰度，各目的蛋白条带与其对应内参的灰度比值代表样品蛋白表达的相对量。

2 结果

2.1 HE染色 Sham组肾组织形态未见异常。UUO组可见部分肾小管上皮细胞肿胀，严重者发生空泡变性，部分肾小管明显扩张，肾间质增宽，并伴有炎细胞浸润。UN组肾小管上皮细胞水肿减轻，扩张肾小管数量减少，肾间质炎性浸润有所改善(图1)。

2.2 肾功能测定 与Sham组相比，UUO组小鼠Scr和BUN升高，而UN组Scr和BUN降低，提示肾功能有所改善(表1)。

2.3 免疫组化检测necroptosis特异性分子标志物RIP1、RIP3、MLKL的表达 RIP1在Sham组远曲小管上皮细胞胞质中有少量表达，在UUO组大量远曲小管上皮细胞胞质和细胞核中均有表达，而UN组RIP1在远曲小管的表达明显减少。Sham组近曲小管胞质中有微弱的RIP3阳性信号，UUO组RIP3在近曲小管胞质中呈强阳性，Nec-1处理后其阳性信号明显减弱。MLKL在Sham组肾小管游离面刷状缘有微量表达，单侧输尿管结扎后肾小管细胞胞质和胞核中均有明显的MLKL表达，但在UN组小管细胞胞质和胞核中表达均显著减少(图2)。

表1 各组小鼠血清Scr和BUN水平

与Sham组相比，**P<0.01；与UUO组相比，##P<0.01

2.4 Western blot检测结果

2.4.1 Nec-1对necroptosis特异性分子标志物RIP1、RIP3、MLKL的影响 建模第7天，UUO组肾组织中RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达水平均较Sham组升高，提示UUO小鼠梗阻肾发生了necroptosis；给予Nec-1治疗后，UN组RIP1、RIP3、MLKL表达量较UUO组显著下降，提示该剂量Nec-1治疗可抑制necroptosis的发生(图3)。

2.4.2 Nec-1治疗减少UUO小鼠肾组织炎症因子TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达 建模第7天，Sham组肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1均微弱表达，UUO组三者的表达较Sham组显著上调；应用Nec-1治疗后，UN组TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达明显降低(图4)。

3 讨论

细胞坏死以细胞膜崩解、细胞器肿胀、线粒体功能丧失为主要特征，并引起严重的炎症反应，存在于各种病理生理过程中，但因其不可调控而未受重视。

Sham组UUO组UN组ABC

图1 HE染色小鼠肾组织形态学改变：A.Sham组未见异常；B.UUO组肾小管水肿、扩张，间质炎性浸润； C.UN组肾小管间质病变改善

图2 各组小鼠肾组织中RIP1、RIP3、MLKL的表达，SP三步法

图3 Western blot法检测各组小鼠肾组织中 RIP1、RIP3、MLKL的表达

A.电泳图；B.直方图；与Sham组比较，**P<0.01；与UUO组比较，##P<0.01，#P<0.05

图4 Western blot法检测各组小鼠肾组织中 IL-1β、MCP-1、TNF-α的表达

A.电泳图；B.直方图；与Sham组比较，**P<0.01；与UUO组比较，##P<0.01

2005年由Degterev等[1]首次报道了一种新型的细胞死亡模式——necroptosis，其具有坏死细胞特征，却是可调控的，Caspase非依赖的程序性细胞死亡，并常伴大量炎细胞浸润。当细胞凋亡途径中Caspase 8功能障碍或被药物阻断时，相应配体(如TNF)[4]激活死亡结构域(DD)，使上游形成的复合物中的RIP1和RIP3紧密结合并相互磷酸化，活化的RIP3进一步导致其底物MLKL等蛋白磷酸化继而引发下游信号通路，启动necroptosis途径。RIP1-RIP3复合物的形成和磷酸化是necroptosis的关键性和特异性步骤[5]，对necroptosis的特异性分子标志物RIP1、RIP3以及RIP3的下游分子MLKL进行检测，可以证明necroptosis的发生[1-3]。有研究显示，necroptosis参与多种炎症反应的发生[2]，在很多动物模型，如小鼠慢性自身免疫性皮肤炎[6]，小鼠心肌缺血再灌注心肌细胞的氧化应激[7]，小鼠痘病毒感染的炎症反应[8]以及临床Crohn病[9]中发挥重要作用。对necroptosis进行适当干预，可能减轻病变组织的炎症反应，减缓疾病进程。

Nec-1是necroptosis的特异性阻断剂，其作用于RIP1和RIP3的激酶活性部位，抑制其相互磷酸化以及RIP1-RIP3复合物的形成和RIP3的激活，从而抑制necroptosis的发生[1-3]，在研究中被广泛使用。新近研究显示,在小鼠急性肺损伤模型中，应用Nec-1可以减轻中性粒细胞依赖的炎症反应[10]；在心肌缺血再灌注模型以及冠脉永久性结扎缺血模型中Nec-1能够有效减少心肌细胞炎性损伤[11]。

本组UUO小鼠建模7天时，RIP1、RIP3、MLKL水平比Sham组明显上调，说明UUO小鼠7天肾组织中发生了necroptosis；而Nec-1治疗后，UN组RIP1、RIP3、MLKL表达水平显著下降，提示Nec-1有效抑制了UUO肾组织中的necroptosis途径，为后续观察necroptosis对炎症反应的作用创造了可靠的前提条件。

在UUO模型中，肾间质的炎症反应以及炎症继发的纤维化是主要的病理过程[12]。该模型中肾间质浸润的炎细胞主要是巨噬细胞和淋巴细胞。TNF-α主要由间质浸润的巨噬细胞和肾小管上皮细胞产生，可导致多种致炎因子爆发性释放，促进炎细胞趋化浸润。IL-1β主要由巨噬细胞分泌，参与免疫细胞的激活，促进炎细胞的聚集与黏附，微血管扩张和通透性增加，诱发炎症反应。MCP-1是重要的巨噬细胞特异性趋化因子，既可以趋化炎症，又可以促进固有细胞释放炎症介质，从而放大炎症反应。通过上述3种炎症因子，可以有效监测UUO肾间质的炎症反应[13]。

本组实验从组织形态学观察可以发现，Nec-1治疗后肾小管的水肿和扩张均有所减轻，肾间质变窄，炎性浸润有所缓解。Western blot结果显示，与Sham组相比，UUO组7天肾组织中TNF-α、IL-1β、MCP-1的表达量均明显增加；而在UN组，Nec-1的治疗明显减少了UUO肾组织中TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达量。由此说明Nec-1抑制necroptosis途径后可显著缓解UUO肾脏的炎症反应。

新近研究报道称，RIP3可以促进IL-1β炎症反应而不激活下游的MLKL[14]。因此，在necroptosis参与UUO炎症反应的过程中，究竟是何种蛋白或信号通路起关键作用，又是如何参与炎症反应的，以及对炎症继发的肾间质纤维化起何种作用，仍待后续研究。但在初步研究中，Nec-1抑制necroptosis从而减轻UUO小鼠肾间质炎症反应的作用已经明了，这可能成为治疗肾间质炎症病变的新靶点。

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Effect of Necrostatin-1 on the inflammation in unilateral ureter obstruction mice

XIAO Xia1, ZHANG Tao2, YANG Xi-da1, TENG Qing1, HOU Jia1, REN Yun-zhuo1

(1DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofNephrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China)

Purpose To observe the effect of Necrostatin-1(Nec-1), a necroptosis inhibitor, on the inflammation in unilateral ureter obstruction mice. Methods Male C57BL/6J mice were randomly divided into sham operation group, unilateral ureter obstruction operation group and UUO+Nec-1 treatment group, and the mice were sacrificed at 7th day after operated. Scr and BUN were measured. The pathological changes in the kidney were observed by HE staining. Immunohistochemistry and Western blot were used to detect the protein expression of necroptosis-related indicators RIP1, RIP3, MLKL and inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and MCP-1. Results Compared with sham operation group, the expression of RIP1, RIP3 and MLKL protein increased in the renal tissue of UUO mice, accompanied with increased expression of TNF-α, IL-1β and MCP-1. Nec-1 treatment significantly decreased above-mentioned protein expression in UUO mice, and also reduced renal interstitial inflammation and renal tubal injury according to HE staining. Scr and BUN levels suggested improved renal function. Conclusion Nec-1 could relieve the inflammatory reaction in renal tissue of the UUO mice by inhibiting necroptosis, which may be a new target for the treatment of secondary inflammation.

inflammation; ureteral obstruction; Necrostatin-1; necroptosis

河北省首批青年拔尖人才项目(QNBJ16002)、河北省卫生厅重点科技研究计划(20150628)、河北省博士后科研资助项目(B2015003028)

1河北医科大学病理学教研室，石家庄 0500172河北医科大学第三医院肾内科，石家庄 050000

肖 夏，女，硕士研究生。E-mail: xiaoxia_63@163.com 任韫卓，女，博士，教授，通讯作者。E-mail: renyunzhuo 1978@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.008.html

R-332； R 692.2

A

1001-7399(2017)08-0863-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.008

接受日期：2017-04-17