葡萄籽原花青素对糖尿病db/db小鼠肾组织细胞表型转化的影响

韦金英，史永红，任韫卓，杜云霞，杜春阳，段惠军，吴海江

葡萄籽原花青素对糖尿病db/db小鼠肾组织细胞表型转化的影响

韦金英，史永红，任韫卓，杜云霞，杜春阳，段惠军，吴海江

目的 观察葡萄籽原花青素对Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠肾脏细胞中表型转化标志蛋白α-SMA、E-cadherin表达的影响，旨在揭示葡萄籽原花青素对db/db小鼠糖尿病肾损伤的保护机制。方法 采用Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠为研究对象，16只雄性db/db小鼠随机分为2组：糖尿病组、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃组，每组各8只；8只相同周龄雄性db/m小鼠作为正常对照组及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治疗对照组。以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，持续12周后检测E-cadherinh、α-SMA、p38MAPK和ERK1/2的蛋白表达。结果 糖尿病组小鼠肾组织中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表达明显增加，E-cadherin表达减少，尿中8-OHdG水平增加。葡萄籽原花青素能减少糖尿病组小鼠肾组织中α-SMA、p38MAPK和ERK1/2蛋白表达，尿中8-OHdG水平也明显降低，而E-cadherin蛋白表达增高(P<0.05)。结论 葡萄籽原花青素抑制肾小管上皮细胞-间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)生成，可能是通过抑制活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成，抑制p38MAPK和ERK1/2信号通路激活而实现的。葡萄籽原花青素对糖尿病肾病具有防治作用。

糖尿病肾病；上皮-间质转化；葡萄籽原花青素；α-SMA；E-cadherin

研究表明，db/db小鼠肾组织中系膜基质的蓄积、小管上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)与活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)生成过多关系密切，主要表现在ROS对组织和细胞的毒性损伤[1-2]。另外，ROS还可作为细胞内信使，活化许多信号传导通路，间接导致组织和细胞的损伤[3-4]。因此，抗氧化治疗可有效减缓多种并发症的发生[5]。本组前期实验结果亦显示，高糖能够使人肾小管上皮细胞及小鼠系膜细胞中ROS增多，同时减少E-cadherin的表达；抗氧化剂NAC能够减少高糖诱导的HK-2中ROS及α-SMA的过表达[6]。天然药物葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是天然的抗氧化剂，具有抗炎、抗凋亡、降血糖、降血脂抗氧化等作用[7-8]。然而，其作用的分子机制尚未完全清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物实验 6～8周龄健康雄性C57BL/ks db/db小鼠，体重(40.0±2.5)g。16只及雄性体重(27±1.6)g的C57BL/ks db/m对照小鼠，购自常州卡文斯实验动物公司。饲养环境为每笼8只，温度为(22±2)℃，相对湿度为(55±2)%。适应性饲养1周。实验开始后，16只雄性db/db小鼠随机分为2组：糖尿病组(db/db组)、糖尿病+葡萄籽原花青素灌胃组(db/db+GSPE组)，每组各8只；相同周龄雄性8只db/m小鼠作为正常对照组(db/m组)及8只db/m小鼠+葡萄籽原花青素灌胃治疗对照组(db/m+GSPE组)。db/db+GSPE组和db/m+GSPE组以葡萄籽原花青素(5 mg/kg)灌胃，每天灌胃1次，对照组和糖尿病组以等体积生理盐水灌胃，持续12周。1.1.2 试剂 兔抗α-SMA、E-cadherin、p-p38MAPK、p38MAPK、p-ERK1/2和ERK1/2多克隆抗体(美国Cell Signaling公司)。兔抗α-SMA和E-cadherin多克隆抗体(美国Abcam公司)。SYBR Premix Ex TaqTMII(日本Takara公司)。兔抗α-actin多克隆抗体(上海蓝基生物公司)。小鼠尿8-OHdG检测试剂盒(中国南京建成试剂公司)。引物序列由上海生工设计合成。18S引物序列：F 5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′，R 5′-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3；α-SMA引物序列：F 5′-CGCCCTCGCCACCAGATCTG-3′，R 5′-TAGCCTTCATAGATGGGGAC-3′；E-cadherin引物序列：F 5′-GCCGGAGCCCTGCCACCCTG-3′，R 5′-CTTTCTGTAGGTGGAGTCCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法检测小鼠尿中8-OHdG的水平 先后加入稀释后的标准品50 μL、待测样品40 μL于反应孔内，立即加入抗8-OHdG抗体10 μL、链霉亲和素-HRP 50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育60 min。甩去孔内液体，震荡洗涤5次，每次30 s。每孔加入显色剂A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃孵育10 min，避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，立即测定结果。在450 nm波长处测定各孔的OD值。结果判断：以标准品的吸光度OD值为纵坐标，相应标准品浓度为横坐标，做出相应曲线，样品含量根据其OD值由标准曲线换算出相应浓度。

1.2.2 免疫组化法检测肾组织表型相关蛋白表达 采用免疫组化SP法进行检测。制备肾组织石蜡切片，切片常规脱蜡至水，3%H2O2甲醇溶液室温孵育10 min，封闭内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗2次，每次5 min，切片加入抗原修复液(0.01 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)，采用高温高压抗原修复法，修复10 min，室温下冷却45 min，PBS冲洗3次，每次5 min，加入正常山羊血清，37 ℃ 30 min封闭内源性生物素，甩掉血清滴加兔抗E-cadherin、α-SMA多克隆抗体(1 ∶150)，4 ℃孵育过夜，次日取出切片，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，每次5 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色，光镜下观察并控制显色程度，蒸馏水冲洗，苏木精复染，阳性部位呈棕黄色，脱水透明，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。结果判定：α-SMA、E-cadherin阳性染色呈棕黄色或棕褐色，位于细胞质或细胞膜。根据阳性细胞百分比制定如下判定标准：<10%阳性细胞为阴性，>10%阳性细胞为阳性。

1.2.3 Western blot法检测p-p38、p38、p-ERK1/2和ERK1/2表达 生理盐水清洗小鼠肾组织后研磨成匀质，加入组织裂解液(25 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，体积分数0.01 NP-40，150 mmol/L氯化钠，质量浓度1 g/L苯甲基磺酰氟)，冰浴2 h，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，Lowry法测定上清液蛋白浓度。组织裂解蛋白40 μg，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳后电转移至PVDF膜；质量分数0.05的脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，加入抗β-actin抗体(稀释比例1 ∶1 000)、p-p38(稀释比例1 ∶1 000)、p38(稀释比例1 ∶1 000)、p-ERK1/2(稀释比例1 ∶1 500)和ERK1/2(稀释比例1 ∶2 000)抗体，4 ℃过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠或兔抗体(1 ∶4 000稀释)，37 ℃孵育2 h；洗膜后加ECL试剂，ODYSSEY远红外双色荧光成像系统显影(LI.COR Gene Company,USA)。用美国UVP公司LabWorks 4.5分析系统软件对Western blot条带进行定量分析。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测肾皮质中α-SMA和E-cadherin mRNA的表达 液氮研磨小鼠肾组织后Trizol法提取细胞总RNA，进行反转录。实时荧光定量PCR步骤：采用20反应体系，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (2×) 10，ROX Reference Dye (50×)0.4，反转录产物2，上、下游引物(终浓度为1 ng/mL)各0.8，双蒸水6。反应条件：95 ℃ 30 s →95 ℃ 5 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共40个循环。根据比较法计算基因表达相对量，采用公式2-ΔΔCt计算基因表达的相对倍数变化。

2 结果

2.1 各组小鼠血、尿生化指标检测结果(表1) 与对照组相比，糖尿病组小鼠尿蛋白(Upro)及尿8-OHdG明显升高；糖尿病db/db小鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)及血中甘油三酯(TG)比对照组db/m小鼠增加(P<0.05)。给予葡萄籽原花青素治疗后血中FBG、Scr、BUN、TG及尿液中8-OHdG、尿蛋白与db/db组比较含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 葡萄籽原花青素对糖尿病肾组织中α-SMA、E-cadherin表达的影响 免疫组化检测结果：db/m组中，α-SMA表达于血管壁，在肾小管细胞胞质中有少量表达、E-cadherin在肾小管细胞质及细胞膜中大量表达；db/db组中，α-SMA在肾小管上皮细胞胞质中大量表达、E-cadherin在肾小管细胞质及细胞膜中表达明显减少(图1)；葡萄籽原花青素灌胃组中α-SMA表达减少，E-cadherin表达明显增多(图1)。

表1 小鼠各组血、尿液生化指标的检测±s)

与db/m组相比，**P<0.01；与db/db组相比，#P<0.05，##P<0.01

ABCDα⁃SMAE⁃cadherin

图1 小鼠肾组织中α-SMA和E-cadherin蛋白表达变化

A.db/m组；B.db/m+GSPE组；C.db/db组；D.db/db+GSPE组

2.4 葡萄籽原花青素对肾组织p-p38MAPK和p-ERK1/2信号通路的影响 与db/m对照组比较，db/db组小鼠肾组织中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表达明显增加；与db/db组小鼠比较，葡萄籽原花青素组肾组织中p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表达减少(P<0.05或P<0.01，图2)

2.5 实时荧光定量PCR结果 与db/m组比较，db/db组小鼠肾组织α-SMA mRNA表达明显增加，E-cadherin表达减少；与db/db组小鼠组比较，葡萄籽原花青素组肾组织中α-SMA mRNA表达减少，E-cadherin mRNA表达增多(P<0.01或P<0.05，图3)。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病常见的严重并发症，其发病机制十分复杂，目前认为出现糖尿病时，大量ROS的蓄积造成的氧化应激状态，参与其发生、发展。而肾小管EMT是导致糖尿病肾损伤的主要机制之一。EMT过程中是上皮细胞失去特征性标志物的表达，同时获得间质标志物表达及伴有细胞形态呈纤维细胞样的改变[1]。其中主要包括了间质细胞标志物α-SMA表达增加、E-cadherin表达减少。研究已证实[9]，慢性高血糖状态诱发的氧化应激在糖尿病肾损伤过程中发挥重要作用，活性氧自由基的产生使肾小管上皮细胞表型改变，推动糖尿病肾病的发生、发展。因此，有效阻断氧化应激、寻找开发有效药物将是防治糖尿病慢性肾病变的重要途径。

葡萄籽原花青素是从葡萄籽中提取的一种天然多酸类化合物，是一种很好的氧自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂，能有效地清除超氧阴离子和自由基，中断自由基链式反应[10]。本组结果显示，在12周的干预实验中，葡萄籽原花青素能够显著降低db/db小鼠尿中ROS(8-OHdG)的产生。同时还发现，给予葡萄籽原花青素治疗后，小鼠α-SMA表达与糖尿病db/db组小鼠比较显著降低，而E-cadherin表达显著增加。提示，抗氧化剂葡萄籽原花青素可以降低db/db小鼠肾小管上皮细胞EMT生成，可能与ROS的产生有关。本组的前期研究结果也表明，抗氧化剂NAC能够减少高糖诱导的EMT生成，通过抑制ROS的产生、抑制p38MAPK和ERK1/2活化来实现[6]。ECM在肾小球系膜区和肾小管间质的过度沉积与糖尿病肾功能进行性下降密切相关，肾病肾间质损伤在糖尿病肾病进展过程中比肾小球损伤更为严重，并且普遍认为EMT可能是糖尿病肾病肾间质纤维化的最重要因素之一[11]。Li等[12]研究表明，葡萄籽原花青素B2能够通过甲基转移酶沉默或LDL诱导的人脐静脉内皮细胞中ERK、GSK3β磷酸化水平降低。也有研究表明[13]，葡萄籽原花青素B2通过ERK和p38MAPK信号通路和Nrf2的易位机制，调控谷胱甘肽转移酶的活性保护结肠Caco-2细胞免受氧化损伤。本组实验发现，db/db组小鼠p38MAPK与ERK1/2的磷酸化水平明显升高，而葡萄籽原花青素组p38MAPK和ERK1/2磷酸化水平降低。提示，在糖尿病db/db小鼠模型中p38MAPK、ERK信号通路参与了细胞转分化的过程，而抗氧化剂葡萄籽原花青素可以抑制p38MAPK、ERK信号通路的激活。

图2 小鼠肾组织中p-ERK1/2、ERK1/2、p38和p-p38蛋白的表达

A.电泳图；B.直方图；1.db/m组；2.db/m+GSPE组；3.db/db组；4.db/db+GSPE组。与db/m组相比，**P<0.01；与db/db组相比，#P<0.05

图3 小鼠肾组织中α-SMA(A)和E-cadherin(B)mRNA的表达

1.db/m组；2.db/m+GSPE组；3.db/db组；4.db/db+GSPE组。与db/m组相比，**P<0.01；与db/db组相比，#P<0.05

葡萄籽原花青素的抗氧化活性使其可抑制高血糖、脂肪酸过氧化等过氧化应激损伤时TNF-α、IL-1等炎性细胞因子的合成和释放，抗炎机制和清除氧自由基、抗脂质过氧化和减少细胞因子的生成有关[14-15]。本实验结果也发现，葡萄籽原花青素能够明显减少db/db小鼠血糖，降低Scr、BUN和高脂血症，降低db/db小鼠的尿8-OHdG水平。提示，葡萄籽原花青素治疗通过抑制血糖、尿8-OHdG水平等方面发挥作用。其与当前的研究结果相一致[8]。

总之，本组实验结果表明，葡萄籽原花青素拮抗db/db糖尿病小鼠肾小管上皮细胞EMT生成，可能是通过抑制ROS的产生及抑制p38 MAPK和ERK1/2活化实现的。但分子机制仍不完全清楚。

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Effect of grape seed proanthocyanidins on phenotype marker protein ofrenal cells in db/db mice

WEI Jin-ying, SHI Yong-hong, REN Yong-zhuo, DU Yun-xia, DU Chun-yang, DUAN Hui-jun, WU Hai-jiang

(DepartmentofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Purpose To investigate the effect of grape seed proanthocyanidins on the phenotype-transforming marker protein expression of db/db renal cells in mice model of type 2 diabetes, and to explore the protective mechanism of grape seed extract on diabetic renal injury in db/db mice. Methods Male db/db diabetic mice were randomly divided into two groups: diabetic group (db/db group) and diabetic+grape seed proanthocyanidin extract group (db/db+GSPE). The same week-old male db/m mice was used as normal controls (db/m) and grape seed proanthocyanidin extract gavage treatment group (db/m+grape seed proanthocyanidin extract group, db/m+GSPE). The mice of db/db+GSPE group and db/m+GSPE group were administered daily with grape seed proanthocyanidin extract (5 mg/kg) by gavage. Results Renal tissues of db/db diabetic mice showed increased expression of α-SMA, p-p38MAPK, p-ERK1/2 and 8-OHdG level, and down-regulation in E-cadherin expression compared with db/m group (P<0.05). However, the alternations of α-SMA, p-p38, p-ERK1/2, E-cadherin protein levels, and 8-OHdG level, in db/db group were reversed by addition of grape seed proanthocyanidin extract (P<0.05). Conclusion Grape seed proanthocyanidin extract inhibits the epithelial to mesenchymal transition (EMT) associated protein, by decreasing ROS production, and activating p38 MAPK and ERK1/2. These findings suggest that grape seed proanthocyanidin extract provides a treatment option for diabetic nephropathy.

diabetic nephropathy; epithelial to mesenchymal transition; grape seed proanthocyanidin extract; α-SMA; E-cadherin

河北省自然科学基金(H2016206482)、河北省高等学校科学技术研究项目(QN2015020)

河北医科大学病理学教研室，石家庄 050017

韦金英，女，博士，副教授。Tel: (0311)86265724，E-mail: wjy-sss@126.com 吴海江，男，博士，副教授，通讯作者。E-mail: haijianglaoqi@163.com

时间：2017-8-20 15:27 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.007.html

R-332

A

1001-7399(2017)08-0858-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.007

接受日期：2017-05-24