ICAM-1、VCAM-1和I-FABP在狼疮肠病小鼠中表达的研究*

霍 静 罗 雯 李明玮 王佩佩首都医科大学附属复兴医院风湿免疫科(100038)

·论 著·

ICAM-1、VCAM-1和I-FABP在狼疮肠病小鼠中表达的研究*

霍 静 罗 雯#李明玮 王佩佩
首都医科大学附属复兴医院风湿免疫科(100038)

背景：系统性红斑狼疮并发狼疮肠病的预后差，目前有关狼疮肠病的发生机制研究甚少。目的：探讨细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)在狼疮肠病小鼠中的表达。方法：将20只MRL/lpr自发性狼疮小鼠随机分为狼疮肠病组和对照组。以TNBS灌肠诱导狼疮肠病模型。行组织学评分，以免疫组化染色检测ICAM-1、VCAM-1、I-FABP表达，并分析其与组织学评分的相关性。结果：与对照组相比，狼疮肠病组结肠组织学评分显著升高(8.1±5.8对0.8±0.5，P=0.000)，ICAM-1(9.4%±2.1%对6.2%±1.1%)、VCAM-1(15.1%±2.1%对12.2%±1.9%)、I-FABP(17.5%±2.5%对6.1%±0.9%)表达均显著升高(P<0.05)。狼疮肠病组结肠组织ICAM-1、VCAM-1和I-FABP表达与组织学评分呈正相关(r=0.870，P=0.010；r=0.881，P=0.010；r=1.000，P=0.000)。结论： ICAM-1、VCAM-1和I-FABP可能与狼疮肠病的发病相关。

红斑狼疮, 系统性； 狼疮肠病； 细胞黏附分子； 血管细胞黏附分子1； 脂肪酸结合蛋白质类

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统受累、血清中含有多种自身抗体的自身免疫性疾病，好发于年轻育龄女性。消化道是SLE最常见的受累系统之一，约半数患者在病程中出现肠道症状[1]。病情一旦进展，内科治疗常无效，而外科治疗不能阻止病变，导致预后差、病死率高。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)作用于粒细胞和淋巴细胞表面，促进粒细胞、淋巴细胞增殖、活化、迁移以及对组织的攻击，导致组织损伤[2]。分子生物学研究证实免疫紊乱导致的组织炎性损伤与黏附分子的表达和上调有关，尤其是ICAM-1、VCAM-1[3]。肠脂肪酸结合蛋白(I-FABP)大量表达于肠黏膜上皮中，当遭受炎症、缺氧、缺血和再灌注损伤时，肠上皮细胞坏死，I-FABP释出，导致肠屏障损伤[4]。MRL/lpr小鼠是一种经典的自发性狼疮小鼠模型，由于缺失Fas基因而使机体自身免疫过度上调，表现出部分狼疮样病理特征[5]。本研究的预实验通过对MRL/lpr小鼠进行TNBS/乙醇灌肠，成功诱发狼疮小鼠的肠病。在此基础上，本研究通过检测ICAM-1、VCAM-1和I-FABP在狼疮肠病小鼠结肠组织中的表达，旨在探讨狼疮肠病的发病机制。

材料与方法

一、实验动物

8周龄雌性MRL/lpr小鼠20只，体质量(20.9±1.6) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于首都医科大学动物部清洁级动物房。

二、研究方法

1. 动物分组：饲养2周小鼠出现SLE表现后，随机分为狼疮肠病组(n=10)和对照组(n=10)。以TNBS/乙醇灌肠制备狼疮小鼠肠病模型[6]。将TNBS(5% W/V)20 μL、无水乙醇50 μL、蒸馏水30 μL 充分混匀。小鼠禁食不禁饮24 h，腹腔注射3.6%水合氯醛进行麻醉。将导管从肛门插入肠道深约5 cm处，灌注TNBS 1.0 mg/50%乙醇灌肠剂100 μL，然后将小鼠倒置60 s，灌肠1次。对照组小鼠不给任何干预，相同条件饲养。所有小鼠灌肠后1周处死，取结肠组织行后续实验。

2. 一般情况：灌肠后给予小鼠正常饮食，每日观察精神状态、进食、活动、体质量和粪便性状等。

3. 组织学评分：取小鼠结肠组织，4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，行HE染色。参照Dieleman等[7]研究的标准，结合炎症、病变深度、隐窝破坏和病变范围评估组织学损伤程度。随机选取10个高倍视野(×400)，取均值作为组织学评分。

4. ICAM-1、VCAM-1、I-FABP的测定：取小鼠结肠组织，常规脱蜡水化，抗原修复，分别加入ICAM-1、VCAM-1和I-FABP一抗(均购自英国Abcam公司，工作浓度均为1∶200)4 ℃过夜；加入二抗，37 ℃ 20 min；DAB显色。Image-Pro Plus 4.1图像分析软件处理结果。

结果判定：以细胞膜和细胞质呈棕黄色作为ICAM-1、VCAM-1、I-FABP表达阳性。高倍(×400)镜下随机选取5个视野，观察细胞染色情况。以阳性细胞数占总细胞的比例作为目的蛋白的表达。

三、统计学分析

结 果

一、一般情况

狼疮肠病组小鼠灌肠第1天即出现精神状态不佳、进食量减少、懒动、体质量逐渐减轻等表现，并出现了稀便、血便症状。对照组小鼠精神状态、进食、活动、体质量和粪便性状均未出现明显变化。

二、结肠组织病理学变化

狼疮肠病组小鼠结肠黏膜层碎裂，结肠上皮细胞不完整。肠腺管状和椭圆形结构破坏(图1A)；黏膜下层、肌层和浆膜层以及固有层大量淋巴细胞聚集，黏膜层被破坏，黏膜肌层断裂形成溃疡，肌层直接接触肠腔内容物(图1B)。对照组小鼠结肠黏膜层显示完整的上皮细胞和肠腺。肠腺被纵切成管状，或横切、斜切成椭圆形。肠上皮与腺上皮之间夹杂大量杯状细胞，固有层可见散在的淋巴细胞。黏膜下层由疏松结缔组织组成，可见血管、黏膜下神经丛和淋巴管等(图1C)。狼疮肠病组组织学评分显著高于对照组(8.1±5.8对0.8±0.5，P=0.000)。

三、结肠组织ICAM-1、VCAM-1、I-FABP表达

狼疮肠病组结肠组织细胞膜和细胞质中可见ICAM-1、VCAM-1和I-FABP呈棕黄色(图2～4)。与对照组相比，狼疮肠病组ICAM-1、VCAM-1和I-FABP表达均显著升高(P<0.05)(表1)。

组别例数ICAM⁃1VCAM⁃1I⁃FABP狼疮肠病组109．4±2．115．1±2．117．5±2．5对照组106．2±1．112．2±1．96．1±0．9

四、结肠组织ICAM-1、VCAM-1和I-FABP表达与组织学评分的相关性分析

狼疮肠病组ICAM-1、VCAM-1和I-FABP表达与组织学评分均呈正相关(r=0.870，P=0.010；r=0.881，P=0.010；r=1.000，P=0.000)。

A：狼疮肠病组；B：对照组

A：狼疮肠病组；B：对照组

讨 论

SLE的基础病理改变是血管炎改变和结缔组织纤维蛋白样变性。结缔组织广泛存在于全身各系统和脏器，故SLE常呈现多系统受累。狼疮肠病是SLE常见的并发症。文献报道狼疮肠病在欧美SLE患者的发病率高达50%[1]，我国达22%[8]。但有关狼疮肠病发病机制的研究甚少。多项研究显示多种病因均能诱发SLE患者的肠病，如肠壁缺血、黏膜屏障受损、针对肠道平滑肌的自身免疫反应、血栓栓塞、药物作用，并通过CT、超声、结肠镜、病理以及同位素等临床检查手段进行了验证[9-10]。狼疮肠病的主要表现包括蛋白丢失性肠病、假性肠梗阻、肠系膜血管炎[11]。上述狼疮肠病的研究仅限于临床层面，与机制相关的学说均是建立在SLE前期研究以及SLE其他系统的研究基础上，缺乏针对狼疮肠病的基础实验。本研究通过TNBS灌肠诱发狼疮小鼠发生肠病，并利用免疫组化法检测结肠组织ICAM-1、VCAM-1、I-FABP表达，旨在初步探究狼疮肠病的发病机制。

黏附分子可分为选择素类、结合素类和免疫球蛋白超家族。ICAM-1和VCAM-1属于免疫球蛋白超家族。在多种炎症因子，包括肿瘤坏死因子、白细胞介素-1等刺激下，由内皮细胞产生ICAM-1、VCAM-1，并作用于白细胞，起黏附和驱化白细胞的作用，最终导致炎症组织损伤[2,12-13]。这一过程被认为是SLE重要的发病机制之一[14-15]。有研究[14]发现，狼疮小鼠中肾脏、心脏、脑组织中ICAM-1、VCAM-1表达明显升高。然而，狼疮小鼠中结肠组织ICAM-1、VCAM-1表达的研究尚未见报道。本研究显示，狼疮肠病小鼠结肠组织ICAM-1、VCAM-1表达明显高于对照组，说明ICAM-1、VCAM-1可能是狼疮肠病的发病机制之一。

I-FABP是脂肪酸结合蛋白家族中的一种低分子质量的胞液蛋白，主要存在于胃肠黏膜上皮细胞中，参与长链脂肪酸的摄取、转运、代谢[16-17]。有研究[18-19]显示当胃肠黏膜遭受炎症、缺氧、缺血和再灌注损伤时，肠上皮细胞被破坏，肠黏膜组织释放I-FABP，造成局部组织和血清I-FABP升高。然而，狼疮小鼠中I-FABP的表达尚未见报道。本研究显示，狼疮肠病小鼠结肠组织中I-FABP表达明显高于对照组，说明I-FABP可能是狼疮肠病的发病机制之一。

综上所述，狼疮肠病小鼠结肠组织中ICAM-1、VCAM-1和I-FABP表达升高，且其表达与结肠组织评分呈正相关。提示ICAM-1、VCAM-1、I-FABP可能是狼疮肠病小鼠的发病机制之一。

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(2016-12-29收稿；2017-03-10修回)

Expressions of ICAM-1, VCAM-1 and I-FABP in Lupus Enteropathy in Mice

HUOJing,LUOWen,LIMingwei,WANGPeipei.
epartmentofRheumatology,FuxingHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing(100038)

LUO Wen, Email: fxlw2006@163.com

Lupus Erythematosus, Systemic; Lupus Enteropathy; Cell Adhesion Molecules; Vascular Cell Adhesion Molecule-1; Fatty Acid-Binding Proteins

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.08.003

*本课题由北京市教委科技计划面上项目(KM201410025020)资助

#本文通信作者，Email: fxlw2006@163.com

Background: The prognosis of systemic lupus erythematosus complicated with lupus enteropathy is poor. At present, studies on pathogenesis of lupus enteropathy are rare. Aims: To investigate the expressions of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and intestinal fatty acid binding protein (I-FABP) in lupus enteropathy in mice. Methods: Twenty MRL/lpr lupus mice were randomly divided into two groups: lupus enteropathy group and control group. Lupus enteropathy model was established by administration with TNBS enema. Histological score was assessed, expressions of ICAM-1, VCAM-1 and I-FABP were determined by immunohistochemistry, and correlations with histological score were analyzed. Results: Compared with control group, histological score was significantly increased (8.1±5.8vs. 0.8±0.5，P=0.000), expressions of ICAM-1 (9.4%±2.1%vs. 6.2%±1.1%), VCAM-1 (15.1%±2.1%vs. 12.2%±1.9%) and I-FABP (17.5%±2.5%vs. 6.1%±0.9%) were significantly increased (P<0.05) in lupus enteropathy group. Expressions of ICAM-1, VCAM-1 and I-FABP in colon tissue in lupus enteropathy group were positively correlated with histological score (r=0.870,P=0.010;r=0.881,P=0.010;r=1.000,P=0.000). Conclusions: ICAM-1, VCAM-1 and I-FABP may be associated with pathogenesis of lupus enteropathy.