女贞子墨旱莲对多发性肌炎模型大鼠肌组织中核转录因子－κB的影响

顾 威 张 杰（辽宁省沈阳市中医院风湿科，辽宁 沈阳 110003）

女贞子墨旱莲对多发性肌炎模型大鼠肌组织中核转录因子－κB的影响

顾 威 张 杰△
（辽宁省沈阳市中医院风湿科，辽宁 沈阳 110003）

目的 研究中药女贞子墨旱莲配伍对多发性肌炎模型大鼠的治疗作用与疗效，阐明养阴滋补肝肾法对多发性肌炎模型大鼠肌组织中核转录因子－κB（NF－κB）的影响。方法 将40只SPF级SD雄性大鼠随机抽取10只作为空白组，其余大鼠皮下注射完全弗氏佐剂与抗原1∶1混合乳化液，成功制备多发性肌炎大鼠模型，成模大鼠随机分为中药组、激素组、模型组，各10只。空白组、模型组给予0.9%氯化钠注射液，激素组给予甲泼尼龙溶液，中药组给予女贞子墨旱莲药物溶液，均给药4周，观察大鼠的一般状态，根据LennonLA的评分标准进行评分，检测血清中血清肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）含量。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肌肉组织中NF－κB的含量水平。结果 在各组大鼠进行干预治疗后，中药组的症状评分低于模型组（P＜0.01），中药组AST水平明显低于模型组（P＜0.01），中药组与激素组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。中药组LDH水平明显低于模型组（P＜0.01），中药组与激素组比较，血清中LDH含量较高（P＜0.05）。中药组CK水平明显低于模型组（P＜0.01），中药组与激素组，血清中CK含量高（P＜0.05）。中药组的NF－κB表达水平明显低于模型组（P＜0.05），中药组与激素组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 中药女贞子墨旱莲阻止炎症细胞凋亡，进而起到抗炎、阻止肌肉组织破坏，是通过抑制NF－κB信号通路，促进抗凋亡蛋白的表达，从而达到对多发性肌炎的治疗作用，表明养阴滋补肝肾法对多发性肌炎模型大鼠肌组织中NF－κB有一定的影响。

多发性肌炎；疾病模型，动物；NF－κB；女贞子；墨旱莲

多发性肌炎（polymyositis，PM）是一种病因未明，累及横纹肌的非化脓性炎症，临床表现以四肢近端、咽部肌肉组织、颈部出现炎症、变性改变，并出现对称性肌无力和肌萎缩，可累及多个系统和器官［1］。当累及到皮肤损害时称为皮肌炎。多发性肌炎、皮肌炎在中医学中还没有相应的医学病名，根据其临床表现和发病机制，早期类似痹证，后期类似痿证［2］。多数患者以阴虚为本，故以养阴滋补肝肾为法治疗多发性肌炎。中药女贞子墨旱莲配伍在临床治疗多发性肌炎方面效果甚佳，但直接将其作为临床一线的指导用药为时尚早，尚且缺乏大数据的支撑。本实验将模拟肌炎的发病过程，将异种动物骨骼肌匀浆作为诱发疾病的抗原物质，建立多发性肌炎大鼠模型，观察中药女贞子墨旱莲对多发性肌炎模型大鼠肌组织中核转录因子－κB（NF－κB）的影响，进一步研究该药物如何影响多发性肌炎的发病过程。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF清洁级SD雄性大鼠（辽宁中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2015 6A032），共40只，体质量（200±20）g，大鼠身体健康，毛色亮泽。

1.2 实验药品 药物组成：女贞子20 g，墨旱莲

20 g。中药采用免煎颗粒，江阴天江药业有限公司生产，每包相当于10 g原药。于辽宁中医药大学附属医院门诊药房购买。甲泼尼龙片由辉瑞公司生产，规格为4 mg／片，30片／盒。

1.3 主要试剂 10%水合氯醛溶液由辽宁中医药大学动物实验中心提供。乙酸（分析纯冰醋酸）由辽宁中医药大学动物实验中心提供。NF－κB酶联免疫吸附法（ELISA）检测试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。完全弗氏佐剂购自sigma，批号1001541106。

1.4 实验用药配置

1.4.1 女贞子墨旱莲药物溶液的制备 本实验的受试药物为女贞子20 g、墨旱莲20 g，中药采用免煎颗粒，每包相当于10 g原药。将上述药物装入相同器皿中，加入约54 mL温水，药物完全融化。200 g大鼠1 d的有效剂量0.126 g，大鼠按给药容积0.1 mL／10 g灌胃，200 g的大鼠大概可以灌2mL的药液，由此确定女贞子墨旱莲水溶液浓度为0.063 g／mL，随后将药液密封存放于4℃的恒温箱中。

1.4.2 甲泼尼龙片溶液的制备 甲泼尼龙片大鼠每日的所需的药物剂量为1.26 mg。将36 mg甲泼尼龙片溶解于22 mL蒸馏水中，制成浓度为0.63 mg／mL的甲泼尼龙片溶液，随后将溶液密封保存于4℃的恒温箱中。

1.4.3 抗原的制备 肌匀浆制备：用空气栓塞法将家兔处死，随后取家兔后肢骨骼肌，将其消毒后放置于冰台上，剔除所有的筋膜、脂肪、血管及神经组织，随后将处理后的组织剪碎，置于冰0.9%氯化钠注射液中浸泡30 min，随后用T10高速分散机进行匀浆处理，转速为30 000 r／min，每次匀浆过程持续15 s，静置30 s，然后用4层纱布将匀浆后的液体进行过滤，滤液用VCX500超声波细胞破碎仪进行破碎，在显微镜下观察，确认无完整细胞后再次利用T10高速分散机对溶液进行离心处理，转速设置为3 500 r／min，最后测定离心后的上层清液中的蛋白含量，结果为13.1 mg／mL。将上层清液分装于多个标准容器中，放置于－80℃冰箱中保存。

1.5 模型建立 先适应性喂养40只SPF级SD大鼠1周，采用随机数字表法，从40只大鼠中随机抽取10只作为空白组，正常饲料喂养饮水。其余30只进行造模，采用背部皮下多点注射完全弗氏佐剂与抗原1∶1混合乳化液4周，每周1次，大鼠的注射剂量为每次0.4 mL，第4周可造模成功。

1.6 分组 第4周将成模大鼠随机分为中药组、激素组、模型组，各10只。

1.7 给药方法 空白组、模型组均每日灌相同剂量2 mL的0.9%氯化钠注射液，共4周。中药组给予中药女贞子墨旱莲水溶液灌胃2 mL，每日1次，共4周。激素组给予甲泼尼龙片溶液2 mL灌胃，每日1次，共4周。在第4周末在麻醉状态下于大鼠的腹主动脉处采集血样，采集完毕后将大鼠全部处死。

1.8 观察指标

1.8.1 大鼠一般状态评分测定 最后1次药物干预后，根据LennonLA评分标准进行评分［3］。0分：肌力大致正常。1分：撕咬、咀嚼或叫喊时无力。2分：行走困难，头下垂，休息时表现尤为明显。3分：无力叫喊，呼吸困难，肌肉明显萎缩，濒临死亡。（症状居中者评为0.5、1.5、2.5分）

1.8.2 血清肌酶测定 用Vitros250型全自动生化分析仪（美国强生公司）检测血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。

1.8.3 NF－κB水平测定 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测肌肉组织中NF－κB的含量水平。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（¯x±s）表示，采用t检验，并对单一因素采用方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠末次给药后评分比较 见表1。

表1 各组大鼠末次给药后评分比较¯x±s

由表1可见，中药组、模型组症状评分高于空白组评分（P＜0.01），提示造模成功。中药组、激素组评分低于模型组（P＜0.01）；激素组评分低于中药组（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠末次给药后AST、LDH及CK比较

见表2。

表2 各组大鼠末次给药后AST、LDH及CK比较U／L，¯x±s

由表2可见，中药组、激素组与模型组比较，血清中AST含量较低（P＜0.01）。中药组与激素组血清中AST含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。激素组、中药组与模型组比较，血清中LDH含量较低（P＜0.01）。中药组与激素组比较，血清中LDH含量较高（P＜0.05）。激素组、中药组与模型组比较，血清中CK含量低（P＜0.01）。中药组与激素组比较，血清中CK含量高（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠末次给药后组织中NF－κB比较见表3。

由表3可见，中药组、激素组与模型组比较，组织中NF－κB低（P＜0.01）。中药组组织中NF－κB与激素组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠末次给药后组织中NF－κB比较¯x±s

3 讨 论

PM是一组骨骼肌非化脓性炎症，其发病机制尚不十分明确，但自身免疫的异常在其发病过程中起重要作用，并与免疫、凋亡、遗传和环境等因素密切相关。我国PM在临床上并不少见，但发病率暂不清楚。美国PM的发病率较低，据统计每10万人中发病人数仅为约0.1～1人，且该病与性别的相关性比较大，女性的患病率是男性患病率的2倍［4］。近来已有研究表明细胞免疫和体液免疫在PM的始发和进展过程中均起相当重要的作用。李静等［5］研究采用免疫染色技术，将NF－κB作为研究目标，通过研究该因子的表达水平来探究其与PM之间的联系，研究表明，在PM患者血清中可检测出肌炎特异性抗体和肌炎相关性抗体，病肌组织中免疫球蛋白和补体的沉积以及坏死肌纤维上C5b－9膜攻击复合物的存在，提示B细胞介导的体液免疫在PM的发生中也起着重要作用。该过程最早在B淋巴细胞中得以证实。NF－κB广泛存在于真核生物中，是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族，许多基因的启动子和增强子区存在κB结合位点，NF－κB参与这些基因表达的调控，与免疫反应、炎症、细胞凋亡、病毒、感染、肿瘤发生以及胚胎发育等重要生命事件密切相关［6］。目前认为细胞免疫及体液免疫均参与了PM的发病，而以细胞免疫为主，肌细胞可见CD4＋、CD8＋T细胞浸润，肌纤维中聚集的炎症细胞释放炎性细胞因子产生一系列免疫反应，损伤肌细胞［7］。PM患者的肌纤维细胞中可检测到NF－κB的过度表达，且细胞出现多个细胞核。越来越多的证据表明NF－κB与自身免疫反应有关，提示NF－κB可能成为今后治疗自身免疫性疾病的一个新的靶点。

PM属中医学痹证、痿证等范畴。《诸病源候论》曰“人体虚，腠理开，故受风邪也”，强调了体虚，先天禀赋不足或后天失养常是PM的发病内在原因，这与现代医学中自身免疫学说不谋而合，成为滋补肝肾的立论依据［8］。多数患者阳盛有热，或阴虚津少，外邪乘虚而入诱导而致病。日久久病不愈，耗损真阴，肝阴不足，累及肾阴，肾阴不足，水不涵木，肝肾阴虚，又易致肝阳上亢或相火偏亢，进而出现阴虚火旺之证［9］。清末《本草备药》明确“益肝肾”作为女贞子的首要功效，此与近代对本品的认识颇为一致。墨旱莲使用较晚，首见于唐代《新修本草》，原名鳢肠。《新修本草》首次记载本品，曰“主血痢，针灸疮发，洪血不可止者敷之立已，汁涂发眉，生速而繁”，朴实地记录了本品内服、外用均可治血证这一主要功用。宋代《日华子本草》则明确本品具“排脓、止血”之功。继后，明代《滇南本草》将其加入“固齿、乌须，洗九种痔疮”之功，而李时珍《本草纲目》则补充了本品“益肾阴”的重要功用。清代，《本草正义》归纳其特征为“入肾补阴而生长毛发，又能入血为凉血止血之品”［10］。女贞子、墨旱莲二者相须为用，有交通季节，顺应阴阳之妙用，是滋补肝肾，明目乌发的妙方［11］，药少而精，性味平和，久服不碍脾胃。

部分医者从现代药理学研究的角度进行了研究及证明，女贞子、墨旱莲有效部位群由女贞子总皂苷、女贞子多糖、墨旱莲总黄酮3种有效部位组成，具有明显的保肝和增强免疫作用［12－13］。姚干等［14］研究结果表明女贞子乙醇提取物＋墨旱莲乙醇提取物（1∶1）是二至丸复方最强的免疫调节作用活性部位，能够协同脂多糖（LPS）、刀豆蛋白（ConA）等有丝分裂原诱导的小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬细胞活性。提示这些组分均能激活T细胞及B细胞，具有丝裂原样作用，可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。女贞子、墨旱莲其免疫调节功能是通过采用碳粒廓清、溶血素抗体测定方法来实现的。研究发现女贞子、墨旱莲水提物能增强单核巨噬细胞的吞噬功能，增强特异性及非特异性免疫力［15］。王进进等［16］用给小鼠服用环磷酰胺致使其免疫力下降，随后再服用女贞子、墨旱莲水提物治疗，研究发现女贞子、墨旱莲水提物可以提高小鼠病理状态下的免疫力，在促进胸腺指数，提高脾功能等方面表现的尤为突出。

PM临床上应用糖皮质激素治疗，已取得了一定的效果，但临床极易引起严重的毒副作用及并发症，长期使用易合并感染、消化道出血、骨质疏松等，且对该药物有依赖性，而有部分患者属于激素抵抗型，激素治疗效果不佳。相对而言，传统中医药通过辨证论治在治疗过程中就发挥了其独特的优势，具有因地制宜、整体观念、副作用小等特点。本研究应用中药女贞子墨旱莲与西药甲泼尼龙做比较，从临床症状方面，中药女贞子墨旱莲治疗多发性肌炎有确切疗效。从理化检查方面，AST、LDH、CK均有显著升高，其中CK升高可达正常值的10～100倍，主要原因是由于肌细胞损伤，使肌肉组织中的心肌酶溢出入血而导致升高，其与肌肉损伤快慢成正比，其可较为全面地反映肌肉的病变程度，应用女贞子墨旱莲后均能降低升高的心肌酶，从而在理化检查上证实中药女贞子墨旱莲确实有改善PM肌肉损伤的作用。在免疫方面，女贞子墨旱莲对PM模型大鼠NF－κB信号通路的影响与西药甲泼尼龙无明显差异，说明中药在女贞子墨旱莲治疗中发挥了细胞免疫效应。女贞子墨旱莲能阻止炎症细胞凋亡，进而起到抗炎、阻止肌肉组织破坏，抑制NF－κB信号通路，促进抗凋亡蛋白的表达，从而达到对PM的治疗作用。

由于PM病情复杂多变，具有整体观念、辨证论治思维体系的中医中药在治疗此病上有其独特优势和巨大潜力。虽然目前各地医家对PM的散在报道仍处于探索阶段，但经长期的临床观察，中医药在治疗PM中已取得可靠的效果，其在减少激素的剂量，减轻毒副作用，稳定病情及减少疾病复发等方面发挥了很大作用。总之，PM辨证施治的全过程，不外乎本虚标实，虚实错杂，因此注意扶正在治疗中的作用，中医药在分期分型、辨证施治及选方用药方面还未形成统一认识，所以今后进一步深入探讨病因病机及治疗机制，掌握辨证规律，形成一套行之有效的中医诊疗该病的理法方药，是医务工作者亟待解决的问题。

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Effect of Ligustrum lucidum ait combined w ith Eclipta on nuclear transcription factor－kappa b in muscletissue of polymyositis model rats

GU Wei*，ZHANG Jie．*
Department of Rheumatology，Hospital of Traditional Chinese Medicine in Shenyang City，Liaoning Provice，Liaoning，Shenyang 110003

Objective To study the therapeutic effect and curative effect of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipta on the polymyositismodel rats，and clarify the effect of nourishing yin of liver and kidney therapy on nuclear transcription factor－kappa b（NF－κB）in muscle tissue of rats with polymyositis.M ethods 10 rats were randomly selected as blank group from 40 SPF grademale rats，the remaining ratswere injected subcutaneously with mixed emulsion of complete Freund＇s adjuvantand antigen by 1：1 for preparing themodel of polymyositis rats successfully，then themodel rats were randomly divided into Chinesemedicine group，hormone group and model group，10 rats in each group.The rats in blank group and model group were given 0.9%sodium chloride injection，hormone group was givenmethylprednisolone solution，Chinesemedicine group was given the solution of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipt.All rats were administered for 4 weeks，then the general state of rats were observed，and the scores were calculated according to LennonLA＇s scoring criteria，the contents of serum creatine phosphokinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH）and aspartate transaminase（AST）in serum weremeasured.The content of NF－κB in muscle tissue was detected by enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）.Results After intervention，the symptom scores in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01）.The AST in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01），and with no statistical difference between Chinese medicine group and hormone group（P＞0.05）.The LDH in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01），and which in Chinese medicine group was higher than that in hormone group（P＜0.05）.The CKin Chinesemedicine group was obviously lower than that inmodel group with statistical differences（P＜0.01），and which in Chinesemedicine group was higher than that in hormone group（P＜0.05）.The expression of NF－κB in Chinesemedicine group was lower than that in model group（P＜0.05），and with no statistical difference between Chinesemedicine group and hormone group（P＞0.05）.Conclusions Chinesemedicine of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipta prevent the apoptosis of inflammatory cells，and then anti－inflammatory and preventmuscle tissue from damage，which is through inhibition the signaling pathway of NF－κB to promote the expression of antiapoptotic protein，so as to achieve the therapeutic effecton polymyositis，and clarify the effectofnourishing yin of liver and kidney therapy on NF－κB in muscle tissue of rats with polymyositis.

Polymyositis；Diseasemodels；Animal；NF－κB；Ligustrum lucidum ait；Eclipta

R－332；R685.205.31

A

1002－2619（2017） 08－1230－05

2017－05－05）

（本文编辑：董军杰）

10．3969／j．issn．1002－2619．2017．08．028

△通讯作者：中国医科大学附属第一医院中医科，辽宁 沈阳 110001

顾威（1984—），女，主治医师，硕士。从事风湿临床研究。