杨树PtYbeY基因克隆及转化拟南芥的研究

陈晨，蒲晶，王宝瑄，张继，蔡昌福，王煜鹏，刘金文

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.中国商业联合会饲料质量监督检测中心）

杨树PtYbeY基因克隆及转化拟南芥的研究

陈晨1，蒲晶1，王宝瑄2，张继1，蔡昌福1，王煜鹏1，刘金文1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.中国商业联合会饲料质量监督检测中心）

为了探究杨树YbeY基因的功能，以毛果杨为材料，采用同源克隆法克隆PtYbeY基因，应用农杆菌介导的花蕾浸泡法异源转化拟南芥atybeY突变体植株，表型分析其生物学功能。序列分析表明，杨树PtYbeY基因的CDS全长1 761 bp，编码568个氨基酸，含有UPF0054 domain和HAD hydrolase-like domain双结构域。异源转化后拟南芥突变体植株由黄色表型恢复为野生型绿色的表型。表型分析结果显示杨树PtYbeY基因可以回补拟南芥atybeY基因突变体的表型，暗示着这两个同源基因有类似的生物学功能，这为进一步阐明PtYbeY的功能及作用机制奠定了分子基础。

杨树；PtYbeY；基因克隆

杨树是杨柳科（Salicaceae）杨属（Populus）植物，为世界广布种，具有适应性最强，速生丰产特点，是森林生态建设、城市绿化和木材工业生产的优良树种[1]。木本植物毛果杨（Populus trichocarpa）全基因组早在2006年发表[2]，其数据库逐年更新，可利用的基因组数据库和植物遗传转化技术的成熟，为木本植物分子生物学研究奠定基础，毛果杨也因此成为木本植物基因工程研究中的模式生物。

YbeY是一个单链特异性的金属离子依赖的内切核糖核酸酶，具有高度保守性，属于UPF0054蛋白家族，几乎存在于所有已测序的细菌中[3-4]。在大肠杆菌中，YbeY首先被鉴定为一个未知功能的热激蛋白，其可能参与翻译过程[5-6]。细菌中YbeY蛋白的遗传功能主要是行使rRNAs的加工和成熟，参与70S核糖体的质量控制[7-8]。最近也有报道，草木樨中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）YbeY的同源蛋白SMc0113有调控sRNAs和mRNAs的功能[9]。

1 材料与方法

1.1 材料

毛果杨（Populus trichocarpa）由中国科学院上海生命科学研究院李来庚研究员赠与；拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型WT（Col-0），拟南芥T-DNA插入突变体CS830701（atybeY-1）购买自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心；大肠杆菌（Escherichia.coli）感受态细胞TOP10（购买自北京原平皓生物技术有限公司）；根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）感受态细胞GV3101株系来自中国科学院上海生命科学研究院，实验室保存；克隆载体18-T Vecto（r购自Takara公司），pENTRTM/SD/D-vector（购自Invitrogen公司）；表达载体pGWB5 vecto（r购自Invitrogen公司）；KOD-plus高保真酶（购自TOYOBO公司）；pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent Kit（购自杭州博日公司）；Prime－RT reagent Kit With gDNA Eraser kit（购自Takara公司）；Gateway LR clonase II enzyme mix（购自Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 植物材料生长条件

拟南芥培养条件：生长的环境温度20～23℃，湿度70%左右，光强为60～120 μmol·m-2·s-1。光周期为，长日照16 h-light/8 h-Dark，短日照8～10 h-light/ 14～16 h-Dark。

毛果杨种植条件：生长温度为24～28℃，光照强度150 μmol m-2s-1，光周期为16-light/8 h-Dark，相对湿度60%。

1.3 引物设计

基于引物设计的基本原则、所用表达载体的类型和遗传功能分析的需要，我们设计克隆杨树PtY－beY基因全长CDS引物：Pt7500-F：CACCATGCTCCCTCGCCTCTCTCCTCTC；Pt7500-R：GAATGCATACTCGTAAATAGCAGAG。其中，上游引物添加CACC四个碱基为构建PtYbeY基因的TOPO载体所需，下游引物去掉CDS的终止密码子TGA为构建PtYbeY基因的pGWB5表达载体所需。引物由Invitrogen公司合成。

1.4 杨树PtYbeY基因扩增、克隆和鉴定

统计检验表明：乐视网股价的日收益率平均值为0.000912，中位数为0.0012，标准差为0.042215，说明存在一定程度的离散，偏度系数Skewness小于0，说明收益率时间序列具有一定程度的左偏，而峰度系数Kurtosis大于3，说明时间序列具有明显的尖峰特征；Jarque-Bera统计量相伴概率接近于0，统计结果拒绝原假设，从而表明收益率时间序列不服从正态分布。时间序列图表明：收益率时间序列存在较大波动，并且具有一定的集聚性和爆发性，可能存在ARCH/GARCH现象。[2]

用pBIOZOL Plant Total RNA Extraction Reagent Kit提取毛果杨幼叶总RNA，用PrimeScripRT reagent Kit With gDNA Eraser kit进行反转录成cDNA，用Pt7500-F和Pt7500-R进行PCR扩增。扩增条件为：94℃3 min，94℃15 s，60℃30 s，68℃2 min，68℃7 min；35个循环。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，胶回收后与TOPO载体连接，转化到Top 10感受态中，抗性筛选，提取质粒，PCR鉴定正确后送Invitrogen公司测序，测序正确的质粒命名为TOPO-PtYbeY。

1.5 杨树PtYbeY基因表达载体的构建和鉴定

用1.4获得的TOPO-PtYbeY载体和CaMV35S启动子驱动的pGWB5植物表达载体，以Gateway LR clonase II enzyme进行LR反应后，转化到农杆菌感受态中，抗性筛选，提取质粒，PCR鉴定正确的质粒命名为pGWB5-PtYbeY。LR反应总体系2.5 μL，25℃过夜连接。

1.6 杨树PtYbeY基因异源转化拟南芥

构建好的pGWB5-PtYbeY植物表达载体，采用冻融法转化根癌农杆菌感受态细胞GV3101，抗性筛选，PCR鉴定正确后，含有pGWB5-PtYbeY植物表达载体的农杆菌扩繁，采用常规的浸花法异源遗传转化拟南芥YbeY基因下调的atybeY-1突变体[11]。

2 结果与分析

2.1 杨树PtYbeY的生物信息学分析

高等植物YbeY蛋白的进化分析表明了YbeY在植物进化中具有高度的保守性[10]。以模式植物拟南芥的AtYbeY蛋白序列同源搜索植物基因组数据库（Pytozome）信息平台的毛果杨基因组，发现毛果杨（P.trichocarpa）中有两个YbeY的同源基因，Locus name分别是Potri.018G057500和Potri.018G055300。Potri.018G055300氨基酸序列全长301aa，含有单一的UPF0054 domain结构域。Potri.018G057500氨基酸序列全称587aa，含有UPF0054 domain和HADhydrolase-like domain双结构域（图1）。我们以毛果杨cDNA为模板，采用同源克隆方法，经PCR扩增后获得Potri.018G057500基因的全长的cDNA克隆片段，我们命名该基因为PtYbeY。

图1 杨树PtYbeY蛋白序列结构Fig.1The structure of PtYbeY protein from Populus

2.2 杨树PtYbeY基因的克隆和TOPO-PtYbeY载体的构建

以毛果杨幼叶为材料提取总RNA经反转录后得到的cDNA为模板，用Pt7500-F和Pt7500-R进行PCR扩增，PCR产物经1%的琼脂糖电泳检测可见一条特异性的大约1 758 bp的条带，与预测的目的基因大小相符（图1 A）。目的片段胶回收后连接TOPO克隆载体，转化至感受态细胞Top 10中，抗性筛选后，提取质粒，质粒的电泳检测符合预构建的目的质粒的大小（图1 B），经质粒PCR检测后测序，克隆测序的片段与已公布的基因组中的基因序列一致性为100%。结果表明，成功克隆到杨树PtYbeY基因，并构建到TOPO克隆载体中，质粒命名为TOPO-PtYbeY。

图2 杨树PtYbeY基因的TOPO载体构建Fig. 2Construction of TOPO vector for PtYbeY gene

2.3 杨树PtYbeY基因的pGWB5植物表达载体的构建

构建好的TOPO-PtYbeY质粒，经LR反应与pGWB5植物表达载体重组后，转化到农杆菌中，抗性筛选，单克隆扩繁提取质粒，电泳检测，大小符合预期结果（图3 A）。该质粒命名为pGWB5-PtYbeY。pGWB5-PtYbeY质粒PCR电泳结果表明杨树PtY－beY基因已整合到表达载体中（图3 B）。鉴定正确的含有pGWB5-PtYbeY质粒的农杆菌-80℃保存，用于下一步的遗传转化实验。

图3 杨树PtYbeY基因的pGWB5表达载体构建Fig. 3Construction of recombinant pGWB5 plasmid for PtYbeY

2.4 杨树PtYbeY基因异源转化拟南芥

为了研究杨树PtYbeY基因的遗传功能，以杨树PtYbeY基因同源的拟南芥AtYbeY基因下调的T-DNA突变体atybeY-1为背景植株，采用农杆菌介导的方法进行异源转化，研究杨树PtYbeY基因的遗传功能。杨树PtYbeY异源回补突变体植株，命名为PtYbeY-OE，经基因组DNA的PCR和转录水平的RT PCR鉴定阳性植株，收集种子种植到T3代，获得纯合体植株。表型分析结果表明，杨树PtYbeY基因异源回补atybeY-1突变体，能使突变体的黄色表型恢复绿色的野生型表型，异源回补的atybeY-1突变体植株的发育到正常水平（图4）。

图4 杨树PtYbeY异源回补突变体表型Fig. 4Phenotype of the PtYbeY complementary mutant

3 讨论

以物种的一些分子特性构建的进化树可以分析相关基因之间的起源关系，了解物种之间的生物系统发生，从而预测其基因的功能。基于细菌YbeY的UPF0054结构域搜索，进化树分析发现从低等植物到高等植物中广泛存在细菌YbeY的同源基因，在进化中具有高度的保守性，暗示着其功能的重要性[10]。生物中YbeY蛋白的功能最初在细菌中被报道[5]，大肠杆菌YbeY遗传学功能是作为核糖核酸内切酶加工，参与16S rRNA的5'和3'末端与23S和5S rRNA的5'末端的成熟[7]。另外，YbeY在大肠杆菌的后期70S核糖体质量控制中也起到重要的作用，它和RNase R共同作用去除缺陷的70S核糖体中功能缺失的30S亚单位[8]。

高等植物的YbeY蛋白与细菌YbeY蛋白的结构域特征的差异，说明生物YbeY蛋白从原核生物（细菌）进化到真核生物（植物）过程中存在进化特征[11]。高等植物中，已有研究表明模式生物拟南芥YbeY蛋白的遗传学功能是参与叶绿体rRNA加工和成熟，干扰叶绿体核糖体的组装，从而影响了叶绿体核糖体翻译活性，进而影响了叶绿体的结构及植株的光合作用[10]。研究的序列分析证实杨树PtYbeY蛋白存在与拟南芥AtYbeY蛋白同样的两个UPF0054 domain和HAD hydrolase-like domain结构域。蛋白结构域（domain）是蛋白质结构、功能和进化的基本单位，不同物种的蛋白存在相类似的结构域暗示着其可能存在相同的生物学功能。杨树PtYbeY异源转化拟南芥atybeY-1突变体，表型分析显示杨树PtYbeY基因可以回补AtYbeY基因下调的拟南芥突变体的表型，从遗传学角度说明两个基因有相似的遗传学功能。研究进一步证实植物YbeY蛋白在从低等植物向高等植物进化过程中具有高度的保守性和功能的重要性，为下一步研究杨树PtYbeY基因遗传学功能奠定了基础。

［1］丁莉萍，王宏芝，魏建华.杨树转基因研究进展及展望［J］.林业科学研究，2016，29（1）：124-132.

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［6］Mukherjee S.YbeY，a heat shock protein involved in translation inEscherichia coli［J］.J Bacteriol，2009，191（8）：2649-2655.

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［11］刘金文.拟南芥核糖核酸酶YbeY参与叶绿体rRNA加工的功能研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2016.

Cloning of PtYbeY from Populus trichocarpa and Transformation into Arabidopsis thaliana

Chen Chen1，Pu Jing1，Wang Baoxuan2，Zhang Ji1，Cai Changfu1，Wang Yupeng1，Liu Jinwen1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agriculture University，Daqing 163319；2.Feed Quality Control Center of China Chamber of Commerce）

In order to explore the function of YbeY in populus，PtYbeY from populous was cloned by RT-PCR method，which was based on published poplar genome data.The gene was introduced into Arabidopsis by the floral dip method and homozygous transgenic plants expressing YbeY gene were identified.Sequence analysis showed that the CDS full-length of poplar PtYbeY gene was 1 761 bp and encoded 568 amino acids，which was contained UPF0054 domain and HAD hydrolase-like domain.The phenotype of transgenic plant by means of heterologous transformation was green of wild type plant compared to yellow of mutant plant.The phenotype analysis showed that PtYbeY could complemented the genetic function of in atybeY mutant of Arabidopsis.The results of the study was indicated that the two homologous genes had the similar biological function，which contributed for further illustrating its function and molecular mechanism．

Populus；PtYbeY；gene clone

TS264.2

A

1002-2090（2017）04-0090-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.020

2015-11-15

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（201610223032）。

陈晨（1994-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院生物科学专业2013级本科生。

刘金文，男，讲师，E-mail：liujinwen@byau.edu.cn。