p38MAPK/MMP-9信号通路对新生大鼠脑缺氧缺血损伤的影响

于沛霞，薄立军，黄立宁，李 欣，徐贯杰*

((1.河北医科大学第三医院麻醉科，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学第二医院麻醉科，河北 石家庄 050000)

·论著·

p38MAPK/MMP-9信号通路对新生大鼠脑缺氧缺血损伤的影响

于沛霞1，薄立军2，黄立宁2，李 欣1，徐贯杰1*

((1.河北医科大学第三医院麻醉科，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学第二医院麻醉科，河北 石家庄 050000)

目的观察依达拉奉对新生大鼠脑缺氧缺血损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的影响，探讨依达拉奉可能通过p38MAPK/基质金属蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)信号通路发挥脑保护作用。方法Rice方法建立新生大鼠(7 d)HIBD模型，随机分为假手术组、HIBD组、依达拉奉组、吡啶咪唑类衍生物(SB203580)组，每组16只。采用五点量表法评估神经功能，并测定脑水含量。检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)浓度。采用酶联免疫法检测MMP-9浓度。采用Western blot法检测细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2)、p38MAPK浓度以及p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38MAPK浓度。结果HIBD组、依达拉奉组、SB203580组神经功能评分和脑含水量明显高于假手术组，SOD活性低于假手术组，MDA含量和MMP-9浓度高于假手术组，依达拉奉组和SB203580组神经功能评分和脑含水量明显低于HIBD组，SOD活性高于HIBD组，MDA含量和MMP-9浓度低于HIBD组(P<0.05)。 HIBD组JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK含量明显高于假手术组、依达拉奉组、SB203580组，ERK1/2、p-ERK1/2含量明显高于假手术组(P<0.05)。结论依达拉奉对新生大鼠(7 d)HIBD的神经保护作用与其抑制促炎介体的产生和下调JNK1/2和p38MAPK活化相关联。其可能与下调P38MAPK/MMP-9通路活性有关。

缺氧缺血，脑；依达拉奉；大鼠

目前我国高龄产妇呈上升趋势，产妇并发症增多，导致新生儿发生脑缺氧缺血损伤(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)不断增加。故有效治疗新生儿HIBD成为热点话题。有研究表明在HIBD炎性和凋亡过程中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号传导途径发挥重要作用。因此，MAPK信号通路成为一个有效的治疗靶点。许多疾病或病理状况的特征是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)短时间内生产过多或聚集过度导致了HIBD病理过程中细胞内信号分子的改变。ROS可引起p38MAPK的活化，而p38MAPK的激活升高了线粒体ROS水平，从而促进了蛋白酶和自由基的大量产生和释放，引起了脑损伤和功能障碍。蛋白酶和自由基的大量产生和释放激活脑组织基质金属蛋白酶9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)，是导致HIBD的主要因素。本研究观察自由基清除剂依达拉奉对新生大鼠HIBD的影响，旨在为进一步了解新生大鼠HIBD的分子机制以及为新生儿HIBD的临床治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验设计 新生7d的健康SD大鼠64只(河北省实验动物中心提供)，随机分为假手术组、HIBD组、依达拉奉组、吡啶咪唑类衍生物(SB203580)组，每组16只。假手术组仅进行手术而不造成缺氧状态,其余3组均采用Rice[1]方法建立新生大鼠HIBD模型。新生大鼠行左侧颈总动脉永久性结扎,2h后置于玻璃缺氧箱中，37 ℃恒温,输入氧浓度为(8±0.1)%的氮氧混合气体持续缺氧2h。假手术组和HIBD组给予生理盐水2mg/kg,依达拉奉组于持续缺氧2h即刻腹腔注射依达拉奉3mg/kg，SB203580组腹腔注射SB203580 3mg/kg。

1.2 神经功能评价 神经功能缺损评价由不知道动物分组的研究者进行，采用五点量表法。正常(无神经功能缺损)0分：大鼠表现正常，完全可以伸开前肢和抬起尾巴；轻度神经功能缺损1分：大鼠不能完全伸展其左前肢，抬起尾巴困难；中度神经功能缺损2分：大鼠已经减少抗侧推，并有轻度神经行为；严重神经功能缺损3分：只转身成一个圆圈，并有轻度和中度神经行为；严重神经功能缺损4分：走路不自然，并出现意识低迷。

1.3 脑水含量测定 同侧和对侧半球称质量(湿质量)并在干燥剂烘箱中干燥(105 ℃)过夜，将干燥的大脑半球再次称质量(干质量)，总脑水含量=[(湿质量-干质量)/湿质量]×100%。

1.4 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测 在冰盘上迅速取出右侧大脑半球，置于-20 ℃冰箱保存备用。采用黄嘌呤氧化酶法测定脑组织匀浆SOD活性。采用硫代巴比妥酸法测定脑组织匀浆MDA浓度。

1.5 大鼠脑MMP-9表达检测 新生大鼠于缺氧后24h，每组随机取8只，断头处死，取脑组织，右侧大脑除去额叶皮质，其余脑组织制成匀浆，以3 500r/min离心10min。采用酶联免疫法检测MMP-9浓度。

1.6Westernblot检测Westernblot法检测各组MAPK通路中细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase1/2，JNK1/2)、p38激酶以及p-JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK的活化及活性。各组用胰酶消化收集细胞，蛋白裂解液处理并制备蛋白样品，应用BCA蛋白质定量试剂盒对蛋白质进行定量后，每组取40μg总蛋白上样。15%SDS-PAGE分离蛋白质，湿转恒流390mA45min将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2h。转膜结束后与浓度为1∶200的一抗反应，室温摇1h后，4 ℃过夜，封闭液洗3次后与二抗反应2h后，充分洗涤后发光、显影、定影、曝光，扫描β-肌动蛋白为内参照。

1.7 统计学方法 应用SPSS23.0统计学软件分析数据，计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组新生大鼠神经功能评分和脑含水量比较HIBD组、依达拉奉组、SB203580组神经功能评分和脑含水量明显高于假手术组，依达拉奉组和SB203580组神经功能评分和脑含水量明显低于HIBD组，差异均有统计学意义(P<0.05)；依达拉奉组与SB203580组神经功能评分和脑含水量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 脑组织SOD活性、MDA含量和MMP-9浓度比较HIBD组、依达拉奉组和SB203580组SOD活性低于假手术组，MDA含量和MMP-9浓度高于假手术组，依达拉奉组和SB203580组SOD活性高于HIBD组，MDA含量和MMP-9浓度低于HIBD组，差异均有统计学意义(P<0.05)；依达拉奉组与SB203580组SOD活性、MDA含量和MMP-9浓度差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别 神经功能评分(分)脑含水量(%)假手术组0.000 76.73±0.66HIBD组3.750±0.463* 82.07±1.15*依达拉奉组1.625±0.518*#79.57±0.57*#SB203580组1.250±0.463*#79.90±0.99*#F 111.70150.100P 0.0000.001

*P<0.05与假手术组比较 #P<0.05与HIBD组比较(SNK-q检验)

组别 SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)MMP-9(ng/ml)假手术组240.081±0.2011.535±0.0203.978±0.446HIBD组190.880±0.540*2.492±0.060*7.328±2.466*依达拉奉组223.392±0.572*#2.027±0.019*#5.232±1.674*#SB203580组219.233±0.466*#1.965±0.021*#5.341±1.460*#F 392.0518.654654.897P 0.0000.0020.000

*P<0.05与假手术组比较 #P<0.05与HIBD组比较(SNK-q检验)

2.3 MAPK通路中JNK1/2、ERK1/2和p38激酶及其磷酸化水平比较 HIBD组JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK含量明显高于假手术组、依达拉奉组、SB203580组，ERK1/2、pERK1/2含量明显高于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)；依达拉奉组与SB203580组JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

组别 ERK1/2p-ERK1/2JNK1/2p-JNK1/2p38MAPKp-p38MAPK假手术组1.0001.0001.0001.0001.0001.000HIBD组1.201±0.032*1.333±0.045*1.480±0.097*1.863±0.054*1.177±0.052*1.820±0.041*依达拉奉组1.056±0.1921.318±0.0390.963±0.046#0.940±0.048#0.923±0.056#1.003±0.040#SB203580组1.036±0.0221.317±0.0260.693±0.378#0.910±0.013#0.848±0.014#0.978±0.019#F 131.78194.17622.1591232.60784.8461465.740P 0.0000.0000.0010.0000.0000.000

*P<0.05与假手术组比较 #P<0.05与HIBD组比较(SNK-q检验)

3 讨 论

新生儿HIBD目前多见于胎儿宫内窘迫和新生儿窒息，是严重威胁新生儿生命和健康的疾病之一。随着我国高龄产妇的日益增多，产妇并发妊娠高血压疾病等增加了宫内窘迫危险，导致胎儿宫内脑缺氧缺血，危及胎儿生命。新生儿脑缺氧缺血导致了新生儿脑损伤，增加了家庭和社会负担。新生儿HIBD是一个包含了能量代谢障碍、兴奋性氨基酸的释放、炎症级联反应、氧自由基合成释放、内环境失衡等的级联损伤过程[2]。Kehrer等[3]认为氧自由基尤其是超氧阴离子，在HIBD过程中导致了脑水肿形成和脑损伤。越来越多的证据表明，MAPK信号通路被激活后，HIBD起着至关重要的作用[4-6]。新生大鼠脑组织发育未成熟，血脑屏障尚未完全建立，能量合成、储备能力不足，原材料缺乏和内源性抗氧化能力不完善，在脑缺氧缺血的条件下，氧自由基容易过度产生，从而进一步加重脑组织水肿和损伤[7]。

本研究使用Rice方法建立HIBD模型，以进一步研究依达拉奉对新生大鼠缺氧性脑病的影响，以及其脑保护作用与MAPK信号通路的关系，结果表明3 mg/kg依达拉奉于脑缺氧2 h即刻给予腹腔注射，能改善新生大鼠神经功能，减轻脑水肿，有脑保护作用。

依达拉奉 (3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一种新型自由基清除剂,对脑组织中具有高度细胞毒性的羟基基团有一定的清除能力，减少羟自由基的产生和清除[8]，减少了迟发性神经元死亡[9],同时抑制组织中的脂质过氧化反应，保护血管内皮细胞的完整性，减轻脑水肿。本研究结果显示，依达拉奉组在大脑皮质缺血半暗带显著提高SOD活性，降低MDA水平。提供了依达拉奉脑缺氧缺血后抗氧化活性的证据。

HIBD通过氧化应激、炎症反应，激活神经元凋亡级联反应，MAPK信号级联参与神经元的存活或损伤[5]。本研究结果显示，磷酸化ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK在新生大鼠脑HIBD模型中缺血半暗带显著增加；依达拉奉组抑制JNK1/2和p38 MAPK活化，但对增加ERK1/2表达没有影响；值得注意的是，依达拉奉对 p-JNK1/2和p-p38MAPK蛋白水平也显著下调。因此，JNK1/2和p38MAPK途径参与了依达拉奉的神经保护作用。活化的JNK和p38蛋白主要功能为介导HIBD和细胞凋亡[10]。脑缺血时，磷酸化ERK、JNK和p38蛋白被激活，磷酸化底物被激活，使p-Elk-1、 p-c-Myc、p-ATF-2和p-c-Jun表达增加，介导细胞死亡[11]。此外，PI3K-Akt信号通路通过抑制JNK和c-Jun表达的激活抑制神经细胞凋亡[10]。许多细胞死亡过程中，通过JNK和p38蛋白途径调节神经元损害。因此，依达拉奉的保护作用可能与JNK1/2和p38MAPK信号通路有关。

MMPs是一组含Zn2+的依赖Ca2+的能降解或修饰细胞外基质的蛋白酶，参与机体的许多生理过程，并发挥重要作用[11]。正常脑组织中只有无活性MMP-9前体，即使MMP-9酶原被激活后也会迅速降解，以防止其过度的活化，造成组织损伤[12]。在某些病理条件下， MMP-9大量活化，降解细胞外基质成分，破坏血脑屏障的完整性，增加组织水肿，导致脑水肿加重[13]。本研究结果显示，HIBD组、依达拉奉组和SB203580组脑组织MMP-9水平明显高于假手术组，证明了HIBD模型造成了脑损伤；依达拉奉组和SB203580组脑组织MMP-9水平明显低于HIBD组，表明依达拉奉处理后，MMP-9水平降低，减轻了对血脑屏障的破坏，减轻了脑水肿，减小了梗死面积，对脑功能有一定的保护作用。依达拉奉组脑功能评分明显高于HIBD组，水肿程度低于HIBD组，进一步证实了依达拉奉的脑保护作用。

炎症反应、MMP-9相互促进，导致炎症瀑布现象发生[14]。p38MAPK在炎症级联反应过程中发挥着重要作用,提示其与MMP-9之间可能存在相互作用。SB203580是p38MAPK的特异性抑制剂,能够特异性地与序列非常相近的蛋白质结合并抑制其活性,从而发挥拮抗炎症的作用。本研究应用p38MAPK特异性激活抑制剂SB203580后,HIBD减轻，MMP-9表达减少，证实p38MAPK信号通路与MMP-9存在密切的关系。依达拉奉组和SB203580组产生相同的效果，进一步证明依达拉奉的脑保护作用可能与p38MAPK/MMP-9信号通路存在密切的关系，依达拉奉通过下调P38MAPK/MMP-9通路活性，发挥脑保护作用。

总之，依达拉奉减轻新生大鼠HIBD的脑保护作用与JNK1/2和p38MAPK活化密切相关。依达拉奉可能通过p38MAPK/MMP-9信号通路，下调P38MAPK/MMP-9通路活性，发挥脑保护作用。

[1] 王琍琍,王杨,宣桂华,等.新生大鼠脑缺氧缺血损伤模型的建立[J].安徽医科大学学报,2004,39(4):259-261.

[2] Wu Q,Chen W,Sinha B,et al. Neuroprotective agents for neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J]. Drug Discovery Today,2015,20(11):1372-1381

[3] Kehrer JP,Klotz LO. Free radicals and related reactive species as mediators of tissue injury and disease:implications for Health[J]. Crit Rev Toxicol,2015,45(9):765-798.

[4] Chang D,Wang YC,Bai YY,et al. Role of P38 MAPK on MMP activity in photothrombotic stroke mice as measured using an ultrafast MMP activatable probe[J]. Sci Rep,2015,5:16951.

[5] Lehotsky J,Petras M,Kovalska M,et al. Mechanisms involved in the ischemic tolerance in brain:effect of the homocysteine[J]. Cell Mol Neurobiol,2015,35(1):7-15.

[6] Newby LK,Marber MS,Melloni C,et al. Losmapimod,a novel p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor,in non-ST-segment elevation myocardial infarction:a randomised phase 2 trial[J]. Lancet,2014,384(9949):1187-1195.

[7] Ma NT,Zhou R,Chang RY,et al. Protective effects of aloperine on neonatal rat primary cultured hippocampal neurons injured by oxygen-glucose deprivation and reperfusion[J]. J Nat Med,2015,69(4):575-583.

[8] Wang T,Zhai L,Guo Y,et al. Picroside Ⅱ has a neuroprotective effect by inhibiting ERK1/2 activation after cerebral ischemic injury in rats[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2015[Epub ahead of print].

[9] Zhao L,Guo Y,Ji X,et al. The neuroprotective effect of picroside II via regulating the expression of myelin basic protein after cerebral ischemia injury in rats[J]. BMC neurosci,2014,15:25.

[10] Vafadari B,Salamian A,Kaczmarek L. MMP-9 in translation:from molecule to brain physiology,pathology,and therapy[J]. J Neurochem,2016,139(Suppl 2):91-114.

[11] Kuhn E,Reis A,Campagnoli EB,et al. Effect of sealing infected dentin with glass ionomer cement on the abundance and localization of MMP-2,MMP-8,and MMP-9 in young permanent molars in vivo[J]. Int J Paediatr Dent,2016,26(2):125-133.

[12] Nagy B,Woth G,Mérei,et al. Perioperative time course of matrix metalloproteinase-9(MMP-9),its tissue inhibitor TIMP-1 & S100B protein in carotid surgery[J]. Indian J Med Res,2016,143(2):220-226.

[13] Lakhan SE,Kirchgessner A,Tepper D,et al. Matrix metalloproteinases and blood-brain barrier disruption in acute ischemic stroke[J]. Front Neurol,2013,4:32.

[14] Yang JS,Lin CW,Su SC,et al. Pharmacodynamic considerations in the use of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol,2016,12(2):191-200.

(本文编辑：赵丽洁)

The effects of P38MAPK/MMP-9 signaling pathway on hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

YU Pei-xia1， BO Li-jun2， HUANG Li-ning2， LI Xin1， XU Guan-jie2*

(1.DepartmentofAnesthesiology，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China； 2.DepartmentofAnesthesiology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

ObjectiveToobservetheeffectofedaravoneonhypoxic-ischemicbraindamage(HIBD)inneonatalratsandtoinvestigatetheprotectiveeffectofedaravoneonbrainthroughp38MAPK/matrixmetalloprotein-9(MMP-9)signalingpathway.MethodsNeonatalratswererandomlyassignedtotheshamoperationgroup,theHIBDgroup,theedaravonegroup,theSB203580group(n=16,eachgroup).ThesurgicalprocedureofHIBDwasdescribedpreviously.Ischemicpenumbraeofthecerebralcortexwereharvestedtodeterminesuperoxidedismutase(SOD),malondialdehyde(MDA).MeasurementsofMMP-9inthebrainsampleswereperformedusingELISA.Measurementsofextracellularsignal-regulatedkinase1/2 (ERK1/2),c-JunN-terminalkinase1/2 (JNK1/2),p38MAPK,p-ERK1/2,p-JNK1/2,andp-p38MAPKconcentrationinthebrainsampleswereperformedusingwesternblotanalysis.ResultsTheneurologicalfunctionscoreandcerebralwatercontentoftheHIBDgroup,edaravonegroupandSB203580groupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup.TheactivityofSODwaslowerthanthatintheshamoperationgroup,andthecontentofMDAandMMP-9werehigherthanthoseoftheshamoperationgroup.TheneurologicalfunctionscoreandcerebralwatercontentofedaravonegroupandSB203580groupweresignificantlylowerthanthoseinHIBDgroup.TheactivityofSODwashigherthanthatoftheHIBDgroup,andthecontentofMDAandMMP-9werelowerthanthoseoftheHIBDgroup(P<0.05).ThecontentsofJNK1/2,p-JNK1/2,p38MAPKandp-p38MAPKinHIBDgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup,edaravonegroupandSB203580group,andthecontentsofERKandpERKweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup(P<0.05).ConclusionTheneuroprotectiveeffectofedaravoneonHIBDinneonatalrats(7d)wasassociatedwithinhibitionofproinflammatorymediatorproductionanddownregulationofJNK1/2andp38MAPKactivation,whichmayberelatedtodownregulationofp38MAPK/MMP-9pathwayactivity.

hypoxia-ischemia,brain;edaravone;rats

2017-06-14；

2017-07-31

河北省医学科学研究重点课题(20130221)

于沛霞(1979-)，女，天津人，河北医科大学第三医院主治医师，医学硕士，从事临床麻醉学研究。

*通讯作者。E-mail：535498241@qq.com

R743

A

1007-3205(2017)09-1063-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.017