吐温-20对Bt抗虫棉外源蛋白提取效率的影响

张富丽，罗 苹*，敬 媛，尹 全，常丽娟，邓 强，牛 蓓，宋 君，王 东

吐温-20对Bt抗虫棉外源蛋白提取效率的影响

张富丽1，2，罗 苹1，2*，敬 媛3，尹 全1，2，常丽娟1，2，邓 强1，2，牛 蓓4，宋 君1，2，王 东1，2

(1.四川省农业科学院分析测试中心，四川成都 610066;2.四川省农业科学院质量标准研究所，四川成都 610066;3.甘孜州农产品质量安全中心，四川康定 626000;4.成都大学医学院，四川成都 610106)

【目的】探究吐温-20对转基因棉中Bt蛋白提取效率的影响程度，为转基因植物外源蛋白提取方法标准化，进而精准转Bt基因棉品种审定准入项目检测数据提供理论依据。【方法】配制7种不同吐温-20含量的提取液，提取抗虫棉GK19及非转基因棉泗棉3号苗期叶片、蕾期叶片和小蕾、铃期叶片和小铃中可溶性总蛋白，测定提取液中Bt蛋白和可溶性总蛋白含量，比较不同吐温-20含量提取液蛋白提取效率的差异。【结果】结果表明，吐温-20对抗虫棉中外源Bt蛋白提取效率有显著影响，蛋白提取缓冲液中吐温-20含量为0.55%是最适的。【结论】在蛋白提取缓冲液中加入适量吐温-20可明显提高抗虫棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影响标准曲线R平方值(R2)。过量添加吐温-20，超过一定的限度，检测变异系数加大，检测值可信度降低，检测结果无意义，因此准确控制蛋白提取缓冲液成分含量十分必要。

吐温-20，抗虫棉，外源蛋白，提取效率

【研究意义】转基因作物带来的巨大经济效益以及对粮食安全、可持续发展及环境与气候变化的贡献促使转基因作物不断地发展壮大。其中，棉花是主要的转基因作物之一。据统计，截止2015年，转基因棉花种植总面积已累计达3亿公顷，采用率已上升至96%[1]。转基因抗虫棉是我国最早实现商业化种植的转基因作物，目前已全面覆盖长江流域和黄河流域棉区，已广泛实现产业化。但品种多、乱、杂已经成为目前转基因棉产业发展的一个突出问题，严重影响其健康发展。为了改变该现状，促进产业良性健康发展，相关职能部门已着手加强行业监管力度，规范和提高安全评价的准入制度。抗虫蛋白表达量就是转基因棉品种申请安全证书的准入门槛审定指标之一。【前人研究进展】酶联免疫吸附测定法(ELISA)是一种利用免疫学原理检测抗原或抗体的技术，因其灵敏度高、快速稳定、操作简便以及定量分析等优点而备受青睐，已逐渐成为转基因产品的检测研究中不可或缺的方法。对于Bt (Cry1Ac/Cry1Ab)毒蛋白的抗体制备及ELISA检测方法，国内外已有大量报道，且近年来亦取得新的进展。2007年，Anna等[2]在ELISA方法的基础上建立了微球免疫的方法用于转基因玉米MON810和Bt11中Bt蛋白的检测，灵敏度分别达到0.018%和0.054%。Shah等人[3]和Wang等人[4]建立了双抗体夹心ELISA法检测转基因棉花中Cry1Ac蛋白的含量，方法的灵敏度和准确度稍有差异。2011年，Zhu等人[5]在量子基础上建立了的荧光联免疫吸附检测方法(QD-FLISA)，检测下限可达2.956 pg/mL。经过数十载发展和优化，ELISA现已广泛地用于蛋白质检测，且多转化为试剂盒进行商业化生产。但是，国内现有Bt蛋白检测试剂盒仍存在特异性不高、缺乏与国外试剂盒严格对比等问题[6]。欧美国家的试剂盒虽然价格偏高，但其稳定性好，接受度高。美国EnviroLogix公司开发的Cry1Ab/ Cry1Ac检测试剂盒就是其中一款较成熟的Bt蛋白检测试剂盒，现已广泛应用于转基因棉抗虫蛋白表达量的研究和检测工作中。Bt抗虫蛋白表达量作为转Bt基因棉品种申请安全证书准入门槛的重要检测项目，对该品种能否成功通过品种审定具有重要意义。研究表明，高温、低温、盐胁迫、渍涝、干旱、肥力条件等环境因素对转基因抗虫棉Bt蛋白表达量有显著影响外，样品存放和处理方法对Bt蛋白含量检测结果也存在明显影响。【本研究切入点】蛋白检测过程中，样本制备质量同样不容忽视，其中起至关重要作用的就是蛋白提取缓冲液。在日常检测中发现，提取缓冲液中吐温-20含量不同，蛋白提取上清呈色深浅不同。因此，提取缓冲液中吐温20含量对抗虫转基因棉Bt外源蛋白提取效率的影响是本研究的关注重点。【拟解决的关键问题】Bt抗虫蛋白表达量作为转Bt基因棉品种申请安全证书准入门槛的重要审定项目，其检测值对该品种能否成功获得安全生产证书具有重要意义。研究表明，高温[7-8]、低温[9]、盐胁迫[10-11]、渍涝[12]、干旱[12]、肥力条件[13]等环境因素对转基因抗虫棉Bt蛋白表达量有显著影响。此外，常丽娟等人[14]研究表明，样品冻存时间、研磨粗细等因素对单位鲜物质质量Bt蛋白含量也存在明显影响。可见，成熟稳定的检测方法和样品制备方法对蛋白表达量检测结果亦起着关键性作用。研究中我们还发现，蛋白检测过程中，样本制备质量同样不容忽视，除了选择良好的样本制备方法，控制好样本制备的条件外，起至关重要作用的就是蛋白提取缓冲液。缓冲液中吐温20含量对抗虫转基因棉Bt外源蛋白提取效率的影响是本研究的关注重点。吐温-20，又名聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，英文名为吐温-20，是一种非离子型表面活性剂，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用，用途广泛，在分子生物学研究中常将其用作水溶性乳化剂、去污剂或封闭剂。在蛋白提取缓冲液中加入，可减少蛋白质间原有互作力产生的破坏，起到稳定蛋白的作用。EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒中配备了PBS粉包(Sigma)，同时推荐使用该粉包制备成含0.55%吐温-20的蛋白提取缓冲液(0.55%T·0.01 mol/L PBS)。不同吐温-20含量的蛋白提取溶液得到的提取上清颜色深浅与蛋白含量是否有直接关系，吐温-20含量是否影响Bt蛋白最终定量检测结果是本文研究的关键问题。作者拟配制不同吐温-20含量的提取缓冲液，提取苗期叶片、蕾期叶片和小蕾、铃期叶片和小铃中Bt蛋白和可溶性总蛋白，研究吐温-20对转基因棉中Bt蛋白提取效率的影响程度，以期转基因植物外源蛋白提取方法进一步标准化，进而完善精确定量外源蛋白检测方法，精准转Bt基因棉品种审定准入项目检测数据提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验所用的转Bt基因抗虫棉为GK 19(鄂抗虫棉1号)，非转基因棉品种为泗棉3号。GK 19转基因棉系将GFMcryIABt基因转入泗棉3号后经系统选育而成的抗虫品种。将转Bt基因抗虫棉及非转基因棉亲本种植于位于成都市彭州市濛阳镇的农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(成都)环境评价基地。试验地土壤肥力水平中等、均匀。4月播种，宽窄行种植(窄行+宽行:0.3 m+0. 7 m)，株距0.5 m。3次重复，采用随机区组设计，每个小区30 m2(5 m×6 m)，每个品种种植3个小区，每个小区种植约100株。常规田间水肥管理。

分别于棉花苗期(4～6片真叶)、蕾期(盛蕾期)、铃期(结铃盛期)，每个小区随机抽取20株植株进行取样。苗期，取顶部倒数第3片完全展开叶。蕾期，取顶部倒数第3片完全展开叶和同株1个小蕾(直径0.5～0.7 cm)。铃期，取顶部倒数第3片完全展开叶和同株1个小铃(直径1 cm)。将各小区采集的同一时期叶片、蕾、铃等各组织器官样品作为一个样本，分别置于保鲜袋内密封，放冷藏保温箱中，迅速带回实验室，液氮速冻，即放入-70℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 蛋白提取缓冲液配制

配制不同吐温-20含量的蛋白提取缓冲液，并分别编号。

A液:0.01mol/L PBS(pH 7.4)，其中含0.138 mol/L NaCl，0.0027 mol/L KCl;B液:0.05%T· 0.01 M PBS，将Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒(EnviroLogix Inc.USA)中的缓冲盐粉末包(Sigma，Cat#P-3563)完全溶于1 L超纯水中，含0.05%吐温-20;C液:0.25%T·0.01 M PBS，将200μl吐温-20加入至100 mL B液中，含0.25%吐温-20;D液:0.55 %T·0.01 mol/L PBS，将500μl吐温-20加入至100 mL B液中，该吐温浓度为EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒推荐Bt蛋白提取液浓度，含0.55%吐温-20;E液:1.05%T·0.01 M PBS，将1000μl吐温-20加入至100 mL B液中，含1.05%吐温-20。F液:2.05%T·0.01 M PBS，将2000μl吐温-20加入至100 mL B液中，含2.05%吐温-20。G液:纯水H2O。缓冲液配制完毕，4℃保存，1周内使用。

1.3 试样的制备

将同一小区叶片样本叠放整齐，对半剪取，加入液氮快速研磨成粉末。小蕾、小铃样本液氮处理后，拍碎混匀取半，加入液氮研磨成粉末。剩余的一半样品留存备用。称取粉末0.1 g于1.5 mL离心管中，分别加入1000 mL各蛋白提取液，混匀。4～7℃低温摇床震荡温浴12 h。4℃，8000 r/min离心20 min后分别取上清，备测。每个样品3次重复。

1.4 吐温-20对标准曲线的影响

分别用0.01 mol/L PBS、0.55%T·0.01 mol/ L PBS及灭菌纯水将Bt标准蛋白(EnviroLogix Inc. USA)稀释成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng/ mL 6个浓度梯度，用于制备2条标准曲线。按EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒操作说明书，分别建立标准曲线。用洗板机BioTek Elx50 (BioTek Instrument，US)洗板，酶标仪BioTekμQuant MQx200(Biotek Instrument，US)读取吸光值，Excel 2007制作标曲。

1.5 Bt蛋白含量的测定

采用EnviroLogix Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒对样品中Bt蛋白含量进行测定。将标准蛋白稀释成1.00、0.80、0.64、0.46、0.28、0.10 ng/mL 6个浓度梯度，并稀释待测样品的Bt蛋白浓度至标准曲线范围内。取50μl标准液和待测样品按试剂盒操作指南进行检测。每个待测样品设两个平行孔。洗板机BioTek Elx50(BioTek Instrument，US)洗板，酶标仪BioTekμQuant MQx200(Biotek Instrument，US)读取450和630 nm波长下的吸光值。分别减去空白对照孔的读数值后，450 nm波长下的余值减去630 nm波长的余值，得到最终测定值。建立标准曲线并计算样品中单位鲜物质质量Bt蛋白的含量。

1.6 可溶性总蛋白含量的测定

按照Pierce®BCA蛋白定量分析试剂盒(Pierce Biotechnology，USA)使用说明书对提取上清中总蛋白含量进行测定。按标准方案(检测范围=20～2000μg/mL)稀释牛血清白蛋白(BSA)标准品，制备25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/mL 8各浓度梯度，水作空白对照，用于制作标准曲线。用水稀释待测样品的可溶性总蛋白质量浓度至标准曲线范围内。取各稀释浓度的蛋白质标准品和待测蛋白质样品各25μl，加入到微孔板中，然后加入BCA工作液200μl，充分混匀，37℃孵育30 min，将微孔板转移到室温下，酶标仪BioTekμQuant MQx200 (Biotek Instrument，US)读取562 nm波长下吸光值。将各个标准品和待测蛋白质样品的吸光值减去空白标准品的吸光值，建立标准曲线并计算样品中单位鲜物质质量可溶性总蛋白的含量。

1.7 数据处理

采用Excel 2007和SPSS 13.0软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 吐温-20对标准曲线的影响

利用0.01 mol/L PBS、0.55%T·0.01 mol/L PBS缓冲液及无菌纯水稀释标准品为1.0、0.82、0. 64、0.46、0.28、0.1 ng/mL 6个浓度梯度，用于制备标准曲线，PBS缓冲液和纯水配制标品溶液制成的3条标准曲线各点分布均呈典型直线性，相关系数R2分别为0.9955、0.9975、0.9975，均大于0.98(图1)。由此可见，在缓冲液中加入适量吐温-20对标准曲线相关系数无影响。

2.2 提取液中不同吐温-20浓度对上清颜色深浅的影响

分别用1.2中A、B、C、D、E、F、G 7种不同吐温-20含量的蛋白提取液过夜低温提取GK19转Bt基因棉花及非转基因常规棉泗棉3号苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃几个时期组织中蛋白，4℃，8000 r/min离心20 min，取上清。如图2所示，不论是转基因棉花GK19或是非转基因棉泗棉3号各时期组织提取上清的颜色都有变化，且变化趋势一致，蛋白提取缓冲液中吐温的含量越高，上清颜色越深。用纯水作为浸提介质，上清颜色最浅。

图1 标准曲线的比较Fig.1 The comparison of two calibration curves

2.3 提取液中吐温-20不同含量对Bt蛋白检测的影响

分别用1.2中7种不同吐温-20含量的蛋白提取缓冲液(编号:A、B、C、D、E、F、G)提取转Bt基因棉花GK19及非转基因常规棉泗棉3号苗期叶片、蕾期叶片、蕾期小蕾、铃期叶片、铃期小铃时期组织，取上清。该上清为蛋白粗提液，稀释100倍后作为待测样品。设3次重复。采用EnviroLogix Cry1Ab/ Cry1Ac检测试剂盒样品中Bt蛋白含量，每个重复样本做2个平行。计算并统计检测平均值(Mean)及相对标准方差(RSD，又称变异系数)。如表1所示，蛋白提取液中吐温的含量对非转基因棉的检测均值影响较小，平均值分布于33.72～71.01，RSD值集中在2～6，不大于8.59。同样吐温含量的蛋白提取缓冲液提取转基因棉样本的Bt蛋白含量检测值与非转基因棉样本情况明显不同。用纯水作为浸提液(试剂G)，提取转基因棉各时期组织的上清的检测值与非转基因棉相当，无明显差异，判定为无Bt蛋白检出。而其他几种蛋白提取缓冲液中吐温浓度越高，Bt蛋白浓度值越大;且结果显示转基因棉各时期的几个组织的检测结果呈现一个共同趋势，即在几个吐温浓度梯度的提取缓冲液中，当吐温含量≤0.55%时，RSD值均较小，不大于4.83;当吐温含量≥1.05%时，其RSD值相对低浓度吐温提取液的值明显增大，其值分布在8.54～16.07，其变异系数均较大。该结果表明，提取液中吐温浓度越大，Bt蛋白检测值越大，但当吐温浓度超过一定限度，其RSD值也相应的增加，其值的可信度降低。因此，提取液中添加吐温可提高Bt蛋白提取效率，但量度宜适中。从本实验结果可确定Bt蛋白的提取必须采用PBS缓冲液，且适度添加吐温可以提高蛋白提取效率，转基因棉组织中Bt蛋白提取缓冲液最适吐温添加浓度为0.55%，苗期叶片、蕾期叶片、蕾期蕾、铃期叶片、铃期铃中Bt蛋白含量分别为233. 36、261.65、294.58、287.41、246.32 ng·g-1FW。

图2 用不同吐温-20含量提取液提取上清颜色比较Fig.2 The color depth comparison of supernatant liquid extracted by buffer with different content of Tween-20

表1 不同时期叶片组织中Bt蛋白含量Table 1 The Bt-protein content in tissues or leaves in different stage of cotton

2.4 提取液中吐温-20不同含量对可溶性总蛋白检测的影响

用7种不同吐温-20含量蛋白提取液(见1.2)提取转Bt基因及非转基因棉几个时期组织的上清，稀释10倍后作为待测样品，用Pierce®BCA蛋白定量分析试剂盒检测可溶性总蛋白含量。无论是转基因棉还是非转基因棉，用纯水从组织中提取上清蛋白检测值较低(表2)，且RSD值偏大;而PBS提取液的RSD值明显较小，在PBS提取缓冲液中加入吐温后，当吐温含量≤0.55%时，其上清的蛋白检测值RSD值不超过6.40。加入吐温后，可溶性总蛋白含量值比未加吐温的蛋白提取液增加，且随着吐温含量的增加，检测值增大。当吐温含量≥1.05%时，可溶性总蛋白含量值显著增大，其相应的RSD值也明显增大，也即其变异系数较大，最高可达22. 14。提取液中吐温浓度越大，可溶性总蛋白检测值越大，但当吐温浓度超过一定限度，其RSD值也相应的增加，其值的可信度降低，进一步说明了蛋白提取缓冲液吐温-20须适度添加。

3 讨 论

吐温-20本身比较粘稠，在蛋白提取缓冲液配制操作过程中，添加吐温-20的时，一定慢慢地吸取，待液面静止不动之后，将移液器靠瓶口沿取出。将吐温-20移到到PBS后，反复抽打，并用PBS抽洗数次，尽量排净，以保证吐温-20准确量取，PBS缓冲液中吐温-20含量精准。

表2 不同时期叶片组织中总蛋白含量Table 2 The total soluble protein content in tissues or leaves in different stage of cotton

本研究结果表明，在Bt蛋白定量检测过程中，在蛋白提取缓冲液中加入适量吐温-20可明显提高抗虫棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影响标准曲线R平方值。R平方值，又称为决定系数，是标准曲线趋势线拟合程度的指标。它的数值大小可以反映趋势线的估计值与对应的实际数据之间的拟合程度，其值越接近1，标准曲线可靠性越高。换句话说，适量吐温-20不影响标准曲线的可靠性。另外，加入吐温量越大，提取上清颜色越深，相应地可溶性总蛋白检测值越大，抗虫转基因棉中外源Bt蛋白检测值亦随着上清颜色加深而增大，而非转基因外源Bt蛋白检测值不会随颜色深浅发生变化。蛋白提取缓冲液中吐温含量、提取上清颜色深浅以及可溶性总蛋白含量三者之间是呈正向关联的。抗虫转基因棉中Bt蛋白是外源Bt基因表达的产物，转基因棉组织可溶性总蛋白中包括外源Bt蛋白，因此总蛋白提取效率越高，相应的外源Bt蛋白提取效率越高;非转基因棉中无外源Bt基因，不会有Bt基因表达蛋白，因此几种蛋白提取缓冲液提取非转基因棉组织上清中Bt蛋白检测值极低，差异亦较小。因此，上清颜色深浅与抗虫Bt蛋白含量不呈正向相关性有力证明了本检测方法对Bt蛋白特异性。与此同时，该结果还表明，蛋白提取缓冲液中不能无限添加吐温-20，超过一定的限度，检测变异系数加大，检测值可信度降低，检测结果无意义。EnviroLogix公司Cry1Ab/Cry1Ac检测试剂盒中推荐使用的蛋白提取缓冲液(0.55%T·0.01M PBS)吐温-20含量为0. 55%是合适的，这与张俊环等人[15]蛋白提取缓冲液中添加0.5%吐温-20最理想的研究结果一致。

在Bt抗虫蛋白表达量检测工作中，一定严格按照标准及规范要求进行操作，除了做好田间水肥管理，使棉花植株保持良好生长状态，在生长发育的关键时期避免缺水干旱、及时排除田间积水、采取防止渍涝危害措施外，还要控制好室内检测条件，控制好试剂配制质量，这是准确检测和评估Bt抗虫蛋白表达量的保障。尤其对于大批量检测样本，保证试剂质量，操持实验条件、处理时间以及处理方法一致的前提下，才可以保障检测结果的可信性，数据之间才能进行有效比对。

4 结 论

吐温-20对抗虫棉中外源Bt蛋白提取效率有显著影响，在蛋白提取缓冲液中加入适量吐温-20可明显提高抗虫棉外源Bt蛋白的提取效率，而不影响标准曲线R平方值(R2)。但过量添加吐温-20，超过一定的限度，检测变异系数加大，检测值可信度降低，检测结果无意义，蛋白提取缓冲液中吐温-20含量为0.55%是最适的。因此准确控制蛋白提取缓冲液成分含量十分必要。

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(责任编辑 李 洁)

Effects of Tween-20 on Extraction Efficiencies of Bt Protein Genetically M odified Cotton

ZHANG Fu-li1，2，LUO Ping1，2*，JING Yuan3，YIN Quan1，2，CHANG Li-juan1，2，DENG Qiang1，2，NIU Bei4，SONG Jun1，2，WANG Dong1，2
(1.Analysis and Determination Center，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;2.Institute of Quality Standard and Testing Technology Research，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Sichuan Chengdu 610066，China;3.Agriculture Products Quality Security Center of Ganzi，Sichuan Kangding 626000，China;4.Medical College，Chengdu University，Sichuan Chengdu 610106，China)

【Objective】The effortwas focused on to reveal the effect of the content of Tween-20 in the buffer solution on the extracting efficiency of Bt protein，as to provide a theoretical basis and references on formulating the standardized methods of protein extraction，and improving the accuracy of the testing data for variety certification admission of transgenic cotton.【Method】Seven extraction solutionswith different amountof Tween-20 were prepared and respectively used for extraction of the total soluble protein in the leaves of cotton seedling，budding stage and cotton boll stage，small buds and small bolls，then the extraction efficiencies of all extraction buffer were compared after the content of foreign Bt protein and total soluble protein were detected.【Result】Tween-20 could dramatically affect the extraction efficiency of foreign Bt protein，and themost proper concentration of Tween-20 in extraction solution was0.55%.【Conclusion】The extraction efficiency of Bt protein could be improved dramatically when proper amount of Tween-20 was added to the extraction solutions and the R2value of stand curve remained unaffected.Excessive use of Tween-20 would result in higher variation coefficient and lower reliability thus accuracy control operation is very necessary in the preparation for the protein extraction buffer.

Tween-20;Insect-resistant cotton;Foreign protein;Extraction efficiency

S562

A

1001-4829(2017)8-1777-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.014

2016-12-16

四川省财政基因工程项目-论文基金(2014LWJJ-011，2016LWJJ-010);四川省财政创新能力提升工程公益深化项目(2016GYSH-032)

张富丽(1978-)，女，副研究员，长期从事转基因植物环境安全评价相关研究，*为通讯作者。