老年难治性颞叶癫痫患者颞叶组织中神经细胞凋亡与caspase-3、-4表达的关系

李 力 李晓宁 张仁宇

(第四军医大学西京医院神经内科，陕西 西安 710032)

老年难治性颞叶癫痫患者颞叶组织中神经细胞凋亡与caspase-3、-4表达的关系

李 力 李晓宁 张仁宇

(第四军医大学西京医院神经内科，陕西 西安 710032)

目的探讨老年难治性颞叶癫痫患者颞叶组织中神经细胞凋亡与信号传导通路中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、caspase-4表达的关系。方法老年难治性颞叶癫痫患者21例为难治性颞叶癫痫组，术中均切除颞叶组织；选取同期因脑外伤入院行手术入路中必须切除的颞叶组织15例为对照组。免疫组化SP法检测颞叶组织中神经细胞caspase-3、caspase-4阳性表达情况；Western印迹检测颞叶组织中caspase-3、caspase-4蛋白表达情况；TUNEL法检测两组神经细胞凋亡情况。结果免疫组化检测显示，难治性颞叶癫痫组颞叶组织中caspase-3、caspase-4阳性细胞表达水平明显高于对照组(P<0.05)。Western印迹检测显示，难治性颞叶癫痫组颞叶组织中caspase-3、caspase-4蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)。对照组颞叶组织中仅存在少量TUNEL阳性神经细胞，难治性颞叶癫痫组中TUNEL阳性神经细胞数明显增多。难治性颞叶癫痫组细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.05)。结论老年难治性颞叶癫痫患者颞叶组织中存在caspase-3、caspase-4传导的神经细胞凋亡，同时caspase-3、caspase-4表达水平与神经细胞凋亡呈正相关。

难治性颞叶癫痫；信号传导；细胞凋亡

癫痫引发神经元凋亡主要包括内源性和外源性两种途径。研究发现，内质网可能是细胞凋亡的另一场所，提出了内质网应激反应性凋亡途径〔1〕。在不同的凋亡途径中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族成员均起到重要作用，其中caspase-3是内源性和外源性途径中共同的终末成分，发挥执行凋亡的作用〔2〕；caspase-4则与人内质网应激凋亡途径密切相关〔3〕。本研究旨在探讨难治性颞叶癫痫患者颞叶组织中神经细胞凋亡情况及信号传导通路中caspase-3、caspase-4阳性表达情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月至2016年5月第四军医大学西京医院收治的老年难治性颞叶癫痫患者21例，术中切除颞叶组织。入选标准：①年龄≥60岁，接受手术治疗，均行头颅CT或磁共振成像(MRI)扫描；②先后单独使用2种以上一线抗癫痫药物且达到最大耐受剂量但治疗仍无效，平均每月癫痫发作≥1次，连续超过6个月；③本次研究通过本院伦理委员会审查，入选患者均签署知情同意书。男14例，女7例；年龄60～72岁，平均(64.05±3.51)岁；病程2～15年，平均(8.54±4.91)年；强直阵挛发作15例，复杂部分性发作4例，单纯部分性发作、失神发作各1例。选取同期因脑外伤入院行手术入路中必须切除的颞叶组织15例为对照组，男9例，女6例；年龄60～70岁，平均(63.61±3.39)岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2主要试剂 兔抗人caspase-3多克隆抗体、兔抗人caspase-4多克隆抗体(上海酶联生物科技有限公司)，工作浓度1∶75；KIT-9710即用型免疫组织化学UltraSensitive TM SP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)；原位细胞凋亡检测试剂盒、DAB显色试剂、磷酸盐缓冲液(PBS)(上海百蕊生物科技有限公司)；GAPDH(碧云天生物技术研究所)。

1.3方法

1.3.1两组caspase-3、caspase-4在神经细胞中的表达 采用免疫组化SP法检测，以已知的阳性切片为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照，操作按检测试剂盒说明书进行，染色呈棕黄或棕黑色颗粒为阳性结果。caspase-3、caspase-4均定位于细胞质，先于低倍镜视野下观察切片总体表达情况，随机选取5个完整视野并在高倍镜视野下拍照。使用Image-Pro Plus图像分析软件测量caspase-3、caspase-4的平均吸光度值。

1.3.2Western印迹检测 RIPA蛋白裂解试剂盒提取两组标本组织的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。95℃变性5 min，取30 μg行PAGE，湿法转移到PVDF膜，奶粉封闭后分别加入兔抗人caspase3、caspase4一抗(1∶1 000稀释)和小鼠抗人GAPDH一抗(1∶3 000稀释)，4℃孵化过夜，加入二抗(1∶3 000稀释)后ECL显色，用荧光图像分析仪采集图像。

1.3.3两组神经细胞凋亡情况检测 采用TUNEL法检测，选择颞叶组织中非坏死区，用已知的阳性切片为阳性对照，用不含TdT的液体替代TUNEL混合液为阴性对照。TUNEL阳性细胞呈棕褐色，表达于细胞核内并呈分散或成片分布，部分染色较深且呈椭圆形或圆形；部分染色不均匀，形态不规则。高倍镜视野下拍照，使用图像分析软件计数阳性细胞数并计算阳性细胞率，取5个视野的均值为凋亡指数。

1.4统计学分析 使用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1两组颞叶组织神经细胞中caspase-3、caspase-4阳性表达情况 对照组颞叶组织神经细胞中存在caspase-3、caspase-4弱表达，难治性颞叶癫痫组caspase-3、caspase-4阳性表达，包括神经元和胶质细胞中均明显增多。难治性颞叶癫痫组caspase-3、caspase-4吸光度值分别为(0.70±0.05)、(0.51±0.08)，明显高于对照组的(0.25±0.03)、(0.19±0.05)(P<0.05)。见图1。

2.2两组细胞凋亡情况比较 对照组颞叶组织中仅存在少量TUNEL阳性神经细胞，难治性颞叶癫痫组TUNEL阳性神经细胞数明显增多。难治性颞叶癫痫组细胞凋亡指数(12.80±2.65)明显高于对照组(2.47±1.13)(P<0.05)。见图2。

2.3Western印迹检测两组caspase-3、caspase-4蛋白表达情况 难治性颞叶癫痫组颞叶组织中caspase-3、caspase-4蛋白灰度值分别为(0.475±0.082)、(0.690±0.103)，明显高于对照组的(0.124±0.031)、(0.183±0.035)(P<0.05)。见图3。

图1 两组caspase-3、caspase-4表达情况免疫组化染色(×400)

图2 两组细胞凋亡情况

图3 Western印迹检测两组caspase-3、caspase-4蛋白在颞叶组织中的表达

3 讨 论

颞叶癫痫是临床常见的难治性癫痫，在动物实验模型中已证实特征性的凋亡变化是癫痫发作后神经元损伤的主要表型〔4〕。癫痫发作时，线粒体中的细胞色素C释放到细胞质中，与胞质中的成分相互作用，激活caspase-3而引发内源性凋亡〔5〕。外源性凋亡主要起始于细胞膜上多种死亡受体活化后聚集相关接头蛋白，进而活化caspase-8、-10，之后激活caspase-3引发凋亡〔6〕。除去内源性和外源性凋亡途径之外，癫痫发病过程中还可诱发内质网应激，导致神经元损伤。caspase-12是内质网应激中一个重要的促凋亡蛋白，但其仅存在于部分啮齿类哺乳动物中，人体中caspase-12基因功能失去〔7〕。相关研究发现，人体中caspase-4基因在内质网应激凋亡途径中的作用类似于caspase-12〔8〕。癫痫导致的慢性脑损伤晚期神经细胞会出现凋亡，因此研究颞叶癫痫神经细胞凋亡的相关机制有助于探寻潜在的抗癫痫途径。本研究提示人难治性颞叶癫痫颞叶组织中神经元和胶质细胞中可能存在凋亡相关的信号传导。Western印迹检测结果说明caspase-3、-4蛋白参与了人难治性颞叶癫痫的凋亡信号传导，其高表达会提升颞叶组织中细胞凋亡水平。由于癫痫病理变化非常复杂，既可能是癫痫的原发改变，也可能是癫痫反复发作后的继发性改变，本研究中探讨的颞叶组织中神经细胞凋亡和促凋亡相关蛋白表达具体是癫痫发病的原因还是发病的结果难以确定，需进一步深入探讨。

1Zheng H,Wang X,Tang Z,etal.The PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways mediate the erythropoietin-modulated calcium influx in kainic acid-induced epilepsy〔J〕.Neuroreport,2013;24(6):335-41.

2Bakir-Gungor B,Baykan B,Iseri SU,etal.Identifying SNP targeted pathways in partial epilepsies with genome-wide association study data〔J〕.Epilepsy Res,2013;105(1/2):92-102.

3Gorter JA,Iyer A,White I,etal.Hippocampal subregion-specific microRNA expression during epileptogenesis in experimental temporal lobe epilepsy〔J〕.Neurobiol Dis,2014;62:508-20.

4Meng FX,You Y,Liu ZL,etal.Neuronal calcium signaling pathways are associated with the development of epilepsy〔J〕.Mol Med Rep,2015;11(1):196-202.

5姜立刚,李 雪,李海平,等.局灶性脑缺血再灌注损伤神经细胞凋亡的研究〔J〕.北华大学学报(自然科学版),2016;17(2):205-8.

6Russo E,Citraro R,Constanti A,etal.The mTOR signaling pathway in the brain:focus on epilepsy and epileptogenesis〔J〕.Mol Neurobiol,2012;46(3):662-81.

7Liu G,Guo H,Guo C,etal.Involvement of IRE1alpha signaling in the hippocampus in patients with mesial temporal lobe epilepsy.〔J〕.Brain Res Bull,2011;84(1):94-102.

8Berdichevsky Y,Dryer AM,Saponjian Y,etal.PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy〔J〕.J Neuroscience,2013;33(21):9056-67.

〔2017-01-11修回〕

(编辑 郭 菁/滕欣航)

第四军医大学教学研究课题(LG201422)

李 力(1976-)，男，博士，主治医师，讲师，主要从事神经重症及脑血管病研究。

R74

A

1005-9202(2017)16-3975-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.030