温肺降浊方对血管性痴呆大鼠学习记忆及Caspase-3蛋白表达的影响

吴 林 唐 农 麻小梅 陈 炜 郑福奎 赵海涛 白硕宇 曾冬娟 杨惠丹 邓 燕

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

温肺降浊方对血管性痴呆大鼠学习记忆及Caspase-3蛋白表达的影响

吴 林 唐 农 麻小梅 陈 炜1郑福奎1赵海涛 白硕宇 曾冬娟 杨惠丹 邓 燕

(广西中医药大学，广西 南宁 530001)

目的研究温肺降浊方对血管性痴呆(VD)大鼠学习记忆及Caspase-3蛋白表达的影响。方法双侧颈总动脉永久性结扎法制做VD模型大鼠，将造模成功的大鼠随机分为模型组，低、中、高剂量温肺降浊方组及石杉碱甲组，另设假手术组。灌胃给予相应药物治疗，连续给药30 d后，用Morris水迷宫检测学习记忆能力，HE染色观察大鼠海马CA1区神经元形态学的改变，Western印迹检测海马组织Caspase-3的表达。结果Morris水迷宫检测结果，温肺降浊方各组平均逃避潜伏期明显低于模型组(P<0.01)，找到平台的次数较模型组明显增多(P<0.01)。HE染色结果表明，温肺降浊方各组能够不同程度地改善海马CA1区神经元形态异常。Western印迹实验结果发现，温肺降浊方各组大鼠海马组织Caspase-3的表达明显低于模型组(P<0.01)。结论温肺降浊方可通过抑制Caspase-3的表达，改善VD大鼠海马CA1区神经元形态异常，从而改善VD大鼠的学习记忆能力。

温肺降浊方；血管性痴呆；学习记忆；Caspase-3

目前血管性痴呆(VD)的发病机制尚不清楚，在发达国家中VD占全部痴呆患者的25%～50%，成为导致痴呆的第二大原因〔1〕。Caspase-3作为Caspase家族中的一员，是凋亡的关键酶，在细胞凋亡过程中处于核心位置，它最终使细胞凋亡能够精确、完整的实施，而海马CA1区神经细胞的大量凋亡丢失，可引起学习记忆障碍，导致VD。本实验拟观察温肺降浊方对VD大鼠的学习记忆能力海马CA1区神经元形态结构、Caspase-3蛋白表达。

1 材料与方法

1.1动物、设备及试剂 3月龄，健康雄性SPF级SD大鼠120只，体重(200±50)g，由广西医科大学动物实验中心提供(许可证号：SCXK桂2009-0002)。由成都泰盟科技有限公司生产的WMT-100型Morris水迷宫设备全套，德国莱卡生产的RM2015型全自动石蜡切片机，日本奥林巴斯公司生产的CX-31型电子显微镜，美国Media Cybernetics公司生产的多功能图像分析管理系统，美国Thermo公司生产的CA91786型 UVP凝胶成像系统，苏木素(北京中杉金桥公司生产，批号：ZLI-9608)，伊红(北京中杉金桥公司生产，批号：ZLI-9612)，Caspase-3抗体(美国Cell Signaling Technology公司生产，批号：9665S)。温肺降浊方，由制附子20 g，党参15 g，炙甘草10 g，干姜10 g，酒大黄10 g，田七10 g共6味中药组成，由我院药剂科统一采购，同比转为中药免煎颗粒剂(由江苏江阴天江药业有限公司提供，批号：1406033)的用量，灌胃时给予温肺降浊方免煎颗粒剂。石杉碱甲片(浙江震元制药有限公司生产，批号：H20033718)。头孢羟氨苄甲氧苄啶胶囊(哈药集团三精制药诺捷有限责任公司生产，批号：H20056737)，用于造模术后预防感染。

1.2VD模型制备 随机从合格的大鼠抽出16只作为假手术组，其余104只大鼠进行VD模型大鼠的制备。参照Ni等〔2〕的双侧颈总动脉永久结扎(2-VO)法将大鼠双侧颈总动脉用4-0无菌蚕丝线永久性结扎制作VD动物模型。假手术组腹腔注射麻醉后行分离双侧颈总动脉手术操作，但不结扎，其余操作及术后处理与模型组相同，以减少手术造成的误差。

1.3Morris水迷宫实验 定位航行实验：设计大鼠进驻平台的时间(逃避潜伏期时间)为60s，然后将各组大鼠按第1、2、3、4象限的顺序，将大鼠面向池壁(大鼠头部向上，以防溺水)依次放入水中，记录其60 s内成功进驻平台(大鼠找到平台并滞留其上5 s为成功)所需时间(即逃避潜伏期)。如果大鼠在60 s内找不到平台，系统则自动停止记录，此时实验者则引导其到平台的位置，让它在平台上停留10 s再取出来，且记录大鼠逃避潜伏期时间为60 s。每只大鼠每天训练4次(上、下午各2次)，连续5 d。取第5天中4个象限逃避潜伏期时间的均数作为学习成绩的检测指标。空间搜索实验：在完成定位航行实验后撤走平台，即水迷宫实验第6天开始进行空间搜索实验。实验时间设置为60 s，将大鼠依次从4个象限放入水中，记录所有大鼠经过原先平台位置的次数，测试大鼠对原平台的记忆，取4个象限跨越平台次数的均数作为记忆成绩的检测指标。

1.4造模成功的判定标准 参照赵宪林等〔3〕的VD模型大鼠筛选标准进行判定，即以假手术组大鼠逃避潜伏期时间的均值为参考值，计算模型组大鼠各鼠的平均逃避潜伏期与参考值之差占该鼠的平均逃避潜伏期时间的比例，该值>20%定为合格的VD大鼠。本次实验中104只大鼠经2-VO法造模后有82只大鼠存活，此82只大鼠经过筛选后，结果有75只大鼠为合格的VD模型大鼠。

1.5实验分组 根据随机数字表，将合格的75只VD模型大鼠随机分到5个组，即模型组15只，低剂量温肺降浊方组15只，中剂量温肺降浊方组15只，高剂量温肺降浊方组15只，石杉碱甲组15只。

1.6灌胃给药 于造模后第15天开始灌胃给药，大鼠灌胃药物剂量的换算方法，均按人与大鼠体表面积系数比确定。给药剂量以临床人用药等效剂量作为中剂量，低、中、高剂量温肺降浊方组给药剂量分别为3.75、7.50、15.0 g·kg-1·d-1，石杉碱甲组给药剂量为0.15 mg·kg-1·d-1。灌胃浓度每天按1 ml/100 g大鼠体重进行。其中假手术组及模型组均予相应体积的双蒸水灌胃。所有大鼠灌胃给药均为1次/d，共30 d。30 d后行Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力的变化情况。

1.7HE染色 Morris水迷宫实验完毕后，每组随机取7只大鼠进行心脏灌注取脑，先后用0.9%生理盐水和4%多聚甲醛进行灌注后，取全脑组织，分别装入有4%多聚甲醛的标本瓶中固定，保存在4℃冰箱中，固定不少于24 h。①经固定后的脑组织，切去嗅球及小脑，常规石蜡包埋，冠状面连续切片，厚度约4 μm；②切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗；③苏木素染色；④1%盐酸酒精分化，1%氨水反蓝；⑤自来水浸泡；⑥置伊红液；⑦常规脱水，透明，封片；⑧在光学显微镜下，观察每组大鼠海马切片CA1区神经元形态结构的变化。

1.8Western印迹实验 用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠后，迅速将大鼠断头，在冰台上快速分离出双侧海马组织，立即置于2 ml EP管中，放入-80℃冰箱保存。①用蛋白裂解液提取蛋白，12 000 r/min离心10 min后取上清分装放入-80℃冰箱保存备用，用考马斯亮蓝试剂盒经紫外可见分光光度计测定蛋白浓度；②制备SDS-PAGE凝胶；③样品的变性及电泳，95℃变性10 min，电泳仪设置成稳压状态，将电压调至50 V使样品通过浓缩胶与分离胶。目的条带跑到分离胶2/3左右位置，停止电泳；④凝胶转膜及洗膜，恒流250 mA转膜，在含有5%的脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h。将封闭后的膜直接放入稀释后的一抗工作液(Caspase-3及抗β-actin的抗体)中，4℃反应过夜。用1×PBST洗膜3次。将二抗(山羊抗兔)用1×PBST稀释3 000倍；将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液中作用90 min。再用1×PBST洗膜3次；⑤曝光及洗片，按1∶1(v/v)混合ECL试剂盒中AB液，放入暗盒中，根据条带的亮度选择适当的曝光时间，经显影定影液显色，用凝胶图像处理系统分析目标带的灰度值。用所测蛋白Caspase-3的灰度值分别与内参照β-actin的灰度值比较，所得的比值表示所测蛋白的相对表达量。

1.9统计学方法 采用SPSS17.0软件行单因素方差分析。

2 结 果

2.1定位航行实验结果 在定位航行的第5天，模型组平均逃避潜伏期比假手术组明显延长(P<0.01)。石杉碱甲组和低、中、高剂量温肺降浊方组的平均逃避潜伏期较模型组明显缩短(P<0.01)。低、中、高剂量温肺降浊方组间平均逃避潜伏期有统计学差异(P<0.01)。低、中、高剂量温肺降浊方组与石杉碱甲组比较均有统计学差异(P<0.01)。见表1。

2.2空间搜索实验结果 模型组较假手术组大鼠成功找到平台的次数明显减少(P<0.01)。而石杉碱甲组和低、中、高剂量温肺降浊方组的平均跨越平台次数均较模型组明显增多(P<0.01)。高、中剂量温肺降浊方组与低剂量温肺降浊方组比较有统计学差异(P<0.01)。各药物组以高剂量温肺降浊方组找到平台的次数为多。见表1。

表1 各组大鼠第5天逃避潜伏期、跨越平台次数比较(±s)

与假手术组比较：1)P<0.01;与模型组比较：2)P<0.01;与石杉碱甲组比较：3)P<0.01;与高剂量温肺降浊方组比较：4)P<0.01

2.3HE染色结果 经HE染色后，细胞质呈淡红色，核呈蓝褐色。假手术组海马CA1区细胞排列整齐，结构清楚，细胞形态完整、正常。模型组海马CA1区细胞排列不整，细胞体积缩小，细胞核固缩、深染。低剂量温肺降浊方组海马CA1区细胞排列尚可，见部分细胞核固缩、深染。中剂量温肺降浊方组海马CA1区排列较整齐，细胞核固缩、深染现象较模型组、低剂量温肺降浊方组少。高剂量温肺降浊方组与石杉碱甲组海马CA1区细胞排列整齐，密度增加，细胞形态、结构完整，神经元形态异常较模型组明显减轻，以高剂量温肺降浊方组作用最为显著。见图1。

2.4Western印迹实验结果 模型组(0.80±0.03)较假手术组Caspase-3蛋白表达明显增加(0.14±0.02，P<0.01)。石杉碱甲组(0.36±0.02)、低、中、高剂量温肺降浊方组(0.58±0.01、0.46±0.01、0.22±0.03)与模型组比较Caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.01)。低、中、高剂量温肺降浊方组三者组间Caspase-3蛋白表达比较有差异(P<0.01)；高剂量温肺降浊方组与假手术组、石杉碱甲组比较有差异(P<0.01)；各药物组中，以高剂量温肺降浊方组抑制Caspase-3蛋白表达的作用最为显著。见图2。

图1 各组大鼠海马CA1区病理改变(HE，×200)

1：假手术组；2：模型组；3：低剂量温肺降浊方组；4：中剂量温肺降浊方组；5：高剂量温肺降浊方组；6：石杉碱甲组图2 各组大鼠海马组织Caspase-3蛋白的变化

3 讨 论

VD发生与肺脏虚损及功能失调关系密切，若肺、肾阳不足、肺气虚损，无以温养脑窍，升机不利则无以充养脑髓，则会导致浊毒、痰湿、瘀血等病理产物堆积致病，最终产生呆、傻、愚、笨的痴呆表现。

脑血管病是引发VD的主要原因，VD形成的重要因素之一即为由颈部血管逐渐狭窄引起的长期慢性脑供血不足。研究表明，当行2-VO法后，前脑组织不会造成血供的完全阻断，而是处于缺血的状态〔4〕。该法实质上较好地模拟了人类因动脉粥样硬化及动脉管腔狭窄等因素导致慢性脑血管疾病因素

引起的VD。赵宪林等〔3〕认为该模型既可以判定药物的效果和治疗的手段，还可用于研究痴呆脑组织的形态、病理以及生理变化的机制。本实验结果证明本实验模型是成功的，而在经温肺降浊方能够不同程度地改善VD模型大鼠海马CA1区神经元形态异常。

Morris水迷宫实验能较真实地反映动物学习与记忆的能力〔5〕。Morris水迷宫近年来在神经生物学、神经药理学、神经病学等领域上有着十分广泛的应用，它是国际上测定动物空间学习及记忆能力方法的常用技术。本实验Morris水迷宫结果显示，模型组大鼠的学习记忆能力明显受到损害，而温肺降浊方对VD模型大鼠的学习记忆能力有改善作用，且存在一定的量效关系。

研究表明，活化后的Caspase-3还可直接诱导线粒体自由基的产生，加速线粒体的功能障碍和细胞色素C释放，使凋亡信号不断放大，涉及范围不断的扩增，最终引起细胞凋亡〔6〕。Caspase-3处于凋亡恶性级联反应的下游，是细胞凋亡的必经之路，它的激活是细胞凋亡进入不可逆转阶段的重要标志。我国科学家利用先进的分子生物学技术证实了Caspase-3基因和凋亡的关系，Caspase-3基因被敲除后，细胞则完全丧失凋亡的能力，然而敲除其他的Caspase基因，细胞的凋亡功能并没有完全丧失〔7〕。由此可知，Caspase-3蛋白表达与否和细胞凋亡的发生关系密切。因此，寻找切断凋亡发生的路径，调节相关凋亡因子的表达，阻止凋亡的发生，改善VD的学习、记忆能力，是治疗VD的关键所在。本实验结果表明温肺降浊方可减少Caspase-3蛋白的表达，抑制神经元凋亡。

1Brayne C，Stephan BC，Matthews FE.A European perspective on population studies of dementia〔J〕.Alzheimers Dement，2011；7 (1)：3-9.

2Ni JW，Ohta H，Matsumoto K，etal.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats〔J〕.Brain Res，1994；653(1)：231-6.

3赵宪林，方秀斌，李东培.大鼠血管性痴呆模型制作〔J〕.中国医科大学学报，2002；31(3)：166-7.

4Garde E，Lykke Mortensen E，Rostrup E，etal.Decline in intelligence is associated with progression in white matter hyperintensity volume〔J〕.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2005；76(9)：1289-91.

5李 林，夏保芦，茹立强，等.血管性痴呆模型大鼠学习记忆障碍的实验研究〔J〕.江汉大学学报，2008；36(4)：54-6.

6Sun M，Zhao YM，Gu Y，etal.Inhibition of nNOS reduces ischemic cell death through down-regulating calpain and caspase-3 after experimental stroke〔J〕.Neurochem Int，2009；7(5-6)：339-46.

7Zheng TS，Flavell RA.Divinations and surprises：genetic analysis of caspases function in mice〔J〕.Exp Cell Res，2000；256：67-73.

〔2016-05-07修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

广西中医基础研究重点实验室系统课题(No.KJT13077)

唐 农(1962-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事脑血管病研究。

吴 林(1970-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事脑血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)16-3922-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.006

1 广西中医药大学第一附属医院