手足口病毒分型及药物干预对免疫功能的影响

钟少龙

(揭阳市人民医院感染科，广东 揭阳 522010)

手足口病毒分型及药物干预对免疫功能的影响

钟少龙

(揭阳市人民医院感染科，广东 揭阳 522010)

目的探讨三种不同手足口病病毒分型与免疫功能的关系及分析药物干预效果。方法选取2014年7月至2016年4月在揭阳市人民医院住院的172例手足口病患儿作为研究对象，将其按照病毒分型分为EV71型组、CoxA 16型组及普通型组，分析不同病毒分型患儿T淋巴细胞亚群因子、免疫球蛋白及补体变化、热毒宁联合利巴韦林治疗后上述指标的变化。结果EV71型组、普通型组的3A期患儿CD3+和CD4+显著低于1期、2期患儿(t=5.05～9.03，均P<0.05)，而3A期患儿的CD8+显著高于1期、2期患儿(t=4.89～8.87，均P<0.05)；CoxA 16型组显效率显著高于EV71型组、普通型组(χ2值分别为5.32、6.36，均P<0.05)，三组的总有效率差异无统计学意义(P>0.05)；治疗5天后，EV71型组CD3+、CD4+/CD8+显著低于CoxA 16型组、普通型组(t=4.82～6.02，均P<0.05)，而IgM显著高于CoxA 16型组、普通型组(t=6.91～10.04，均P<0.05)；治疗5天后，CoxA 16型组IgA显著高于EV71型组、普通型组(t=4.88～5.29，均P<0.05)，而CD8+显著低于EV71型组、普通型组(t=5.81～7.71，均P<0.05)；各组患者在不良反应发生率方面，差异无统计学意义(χ2=1.07，P>0.05)。结论EV71型手足口病患儿免疫功能紊乱更为严重，采用热毒宁联合利巴韦林治疗后，CoxA 16型病毒患儿免疫功能恢复更快。

手足口病；病毒分型；免疫功能；重组人干扰素α-2b；热毒宁；利巴韦林

手足口病是由多种肠道病毒导致的急性传染病，该病全年均有发生。手足口病的病情轻重差别较大，如普通病患的病程呈自限性，而重症患者的病情迅速恶化，甚至出现死亡[1]。手足口病的发生与病毒直接侵犯细胞，导致病毒在细胞内大量繁殖，造成宿主细胞死亡有关。有研究发现T淋巴细胞亚群及免疫球蛋白参与了手足口病的病情变化[2]。感染手足口病的病毒有20多种，其中最为常见的是肠道病毒71型(enterovirus type 71 infections，EV71)和柯萨奇病毒A16(Coxsackie virus A16，CoxA 16)[3]。目前对于不同病毒分型手足口病患者免疫功能变化的研究报道较少。本研究旨在探讨不同病毒分型手足口病患儿免疫功能指标的变化，采用药物干预后T淋巴细胞因子、免疫球蛋白及补体的变化，以期为临床研究手足口病的药物治疗提供一定的理论基础。

1资料与方法

1.1研究对象

选取2014年7月至2016年4月在揭阳市人民医院住院的172例手足口病患儿作为研究对象(研究组)，其中男103例，女69例；年龄在13个月～5岁，平均年龄(2.46±1.29)岁；病程2～9天，平均病程(4.18±1.85)天。另选取同期到本院体检健康儿童42例作为对照组，其中男26例，女16例；年龄在18个月～5岁，平均年龄(2.66±1.31)岁。对照组与研究组在性别构成比、年龄方面比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。根据卫生部颁布的《手足口病诊断治疗指南》(2010年版)标准[4]将研究组患儿分为3期：其中1期100例，2期56例，3A期16例。根据病毒分型将研究组患儿分为EV71型组50例、CoxA 16型组51例及普通型组71例。

1.2纳入和排除标准

纳入标准：①符合2010年版手足口病普通病例的诊断标准[4]；②临床表现特征为急性起病、发热，患儿的手、足或/和臀部出现疱疹、斑丘疹，周围有炎性红晕，同时伴有流涕、咳嗽、食欲不振等；③口腔溃疡出现的时间较手、足、臀部疱疹的时间早；④血常规检测正常或者白细胞略有升高；⑤征得患儿监护人同意，并签订知情同意书。

排除标准：①药物过敏者；②合并有其他心、肺、脑等器官疾病；③伴有严重的细菌感染；④合并感染水痘、湿疹或者口蹄疫等疾病；⑤伴有严重营养不良、血液病者；⑥依从性差或者中途退出研究者。

1.3标本采集及RT-PCR检测病毒分型

采集所有手足口病患儿咽拭子标本，采用专用棉签轻度拭患儿咽喉后壁及两侧扁桃体部位，迅速将棉签放入3mL生理盐水的标本采样管中，盖紧管盖密封，于-20℃低温冷冻保存。

将所得标本悬液采用低温离心机以3 000r/min离心10min后，去除沉淀。按照QIAamp MinElute Virus Spin 试剂盒(Qiagen，德国)提取样本上清全核酸，按照SuperScript Ⅲ reverse transcriptase试剂盒(Invitrogen，美国)对全核酸进行cDNA的合成。对所有样本的cDNA进行病毒巢式PCR诊断检测。通过引物扩增，在154bp处特异性条带为病毒阳性结果，对于不确定的结果需要进行测序分析从而判定检测结果。将巢式PCR检测为阳性的样本进行病毒5’UTR(非转录区)的长约480bp片段进行扩增，5’UTR序列测序取出载体极易引物序列后，通过美国国家生物技术信息中西(NCBI)数据库进行BLAST比对，其中以超过97%以上的最高一致性分数的基因型作为病毒分析的结果。

1.4免疫功能指标的检测

抽取各组患儿住院次日清晨及治疗5天后空腹静脉血各4mL，其中2mL血液用含有EDTA的抗凝管收集，采用流式细胞术(FACS Calibure流式细胞仪，美国BD公司)检测T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+；另2mL血液标本收集于干燥管中，以15 000r/min离心10min，取血清，免疫散射比浊法检测免疫球蛋白及血清补体(全自动蛋白分析仪，德国BN ProSpec公司)。

1.5治疗方法

各组患者根据需要给予常规的手足口病治疗，例如：抗感染、补充电解质、补液，及氨基酸、脂肪酸等营养药物的支持，抗病毒采用利巴韦林注射液(国药准字H19993919，0.1g/支)0.1g加入200mL的5%葡萄糖注射液中静脉滴注，每日1次；口腔溃疡应用开喉剑(国药准字Z20026493，20mL/支)每次1支，每日1次；热毒宁注射液(国药准字Z20050217，10mL/支)，每次2支，每日1次，静脉滴注。治疗5天为1个疗程，在治疗期间需要密切关注患儿的发热消退时间，疱疹、斑丘疹消退时间，口腔溃疡愈合时间及住院时间，同时需要记录不良反应的发生情况。

1.6临床疗效评估及不良反应

治疗5天后，观察对照组、研究组及其各亚组的综合疗效。显效：治疗3天内，体温恢复正常，手足疱疹、斑丘疹及口腔溃疡完全消退，饮食恢复正常，一般状况正常；有效：治疗3～5天内，体温降至正常、手足疱疹、斑丘疹及口腔溃疡基本消退，无散在新皮疹出现，饮食得到了一定程度改善，一般状况有所好转；无效：治疗5天后仍然发热，体温下降小于1℃，手足疱疹、斑丘疹及口腔溃疡未消退或者有所增加，且有新的皮疹出现。总有效率=显效率+有效率。治疗5天后观察各组出现不良反应的发生情况。

1.7统计学方法

2结果

2.1各组患儿的一般临床资料

各组患儿的性别、病程、年龄、临床分期、口腔溃疡及神经系统症状方面比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 各组患儿的一般临床资料比较结果

2.2不同病毒分型免疫功能的变化

研究组中不同病毒分型组的各项免疫功能指标(除C3C、C4外)与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)；EV71型组、普通型组的3A期患儿CD3+和CD4+显著低于1期、2期患儿(均P<0.05)，而3A期患儿的CD8+显著高于1期、2期患儿(均P<0.05)；CoxA 16型组的3A期患儿IgA、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高于EV71型组、普通型组3A期患儿(均P<0.05)，而3A期患儿的IgM、IgG、CD8+显著低于EV71型组、普通型组3A期患儿(均P<0.05)，见表2。

表2 不同病毒分型免疫功能变化比较结果

(续表2-1)

组别临床分期CD8+(%)tCD4+/CD8+(%)t对照组16.24±4.172.39±0.61研究组 EV71型组1期22.64±4.51▼5.94▼、6.26、7.061.57±0.47▼5.94▼、6.26、7.062期26.28±4.99▼5.18*1.32±0.42▼5.18*3A期35.54±5.07*#▼8.17#1.24±0.39*▼ CoxA16型组1期21.98±4.48▼5.94▼、6.26、7.061.61±0.49▼5.94▼、6.26、7.062期26.35±4.79▼5.18*1.51±0.47▼5.18▲3A期27.14±4.82*▲▼9.03▲1.47±0.42▲▼ 普通型组1期22.17±4.58▼5.94▼、6.26、7.061.59±0.49▼5.94▼、6.26、7.062期25.96±4.88▼4.89*1.35±0.46▼5.18*3A期33.47±5.01*#△▼8.87#、6.15△1.27±0.41*△▼9.03△

(续表2-2)

组别临床分期IgA(g/L)tIgM(g/L)t对照组1.67±0.460.90±0.34研究组 EV71型组1期0.98±0.41▼6.78▼、5.32、4.861.46±0.47▼6.52▼、7.31、5.492期0.76±0.39*▼9.93、5.68*1.77±0.53*▼4.88*、5.403A期0.71±0.36*▼1.93±0.59*▼ CoxA16型组1期0.96±0.43▼3.67▼、9.93、5.381.48±0.48▼5.72▼、6.19、5.682期0.89±0.42▲▼6.12▲、7.461.56±0.51▲▼6.73▲、5.543A期0.86±0.38▲▼1.59±0.54▲▼ 普通型组1期0.99±0.45▼4.96▼、7.21、6.151.47±0.46▼6.04▼、7.98、8.852期0.81±0.40▼8.03*1.63±0.54▼5.14*3A期0.70±0.35*△▼6.49△1.96±0.56*△▼6.17△

(续表2-3)

组别临床分期IgG(g/L)tC3C(g/L)C4(g/L)对照组8.11±2.071.29±0.290.35±0.21研究组 EV71型组1期8.65±2.04▼4.992▼、6.174、7.7411.26±0.340.33±0.222期9.03±2.11▼5.019*1.20±0.310.30±0.213A期9.84±2.18*▼1.21±0.320.30±0.24 CoxA16型组1期8.43±2.05▼3.772▼、4.965、5.0061.27±0.350.33±0.222期8.88±2.14▼1.22±0.310.31±0.203A期9.14±2.08▼1.21±0.290.30±0.21 普通型组1期8.71±2.07▼4.693▼、5.072、4.9381.28±0.330.34±0.212期9.09±2.10▼7.048*1.22±0.340.33±0.223A期9.85±2.15*▼1.24±0.330.31±0.24

注：*与1期比较，P<0.05；#与2期比较，P<0.05；▲与EV71型组比较，P<0.05；△与CoxA 16型组比较，P<0.05；▼与对照组比较，P<0.05。

2.3各组患儿的临床疗效

CoxA 16型组显效率显著高于EV71型组、普通型组(χ2值分别为5.32、6.36，均P<0.05)，三组的总有效率差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组患儿临床疗效比较结果[n(%)]

2.4各组治疗前后免疫功能指标的变化

治疗前各分型组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM及IgG与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；治疗5天后，EV71型组、普通型组CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，而与CoxA 16型组差异均无统计学意义(均P>0.05)；治疗5天后各组患儿CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgA均显著升高，与治疗前比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，而CD8+、IgM均显著降低，与治疗前比较差异均有统计学意义(均P<0.05)；治疗5天后，EV71型组CD3+、CD4+/CD8+显著低于CoxA 16型组、普通型组(均P<0.05)，而IgM显著高于CoxA 16型组、普通型组(均P<0.05)；治疗5天后，CoxA 16型组IgA显著高于EV71型组、普通型组(均P<0.05)，而CD8+显著低于EV71型组、普通型组(均P<0.05)，见表4。

表4 各组治疗前后免疫功能指标变化比较结果

(续表4-1)

组别时间点CD8+(%)tCD4+/CD8+(%)t对照组16.24±4.172.39±0.61研究组 EV71型组治疗前27.78±5.05△4.73△、5.821.29±0.42△5.47△、8.26治疗后21.63±4.47*△4.88*1.74±0.51*△8.19* CoxA16型组治疗前25.52±4.98△7.18△1.31±0.36△6.86△治疗后15.68±4.06*#5.02*、5.81#2.32±0.62*#4.38*、5.92# 普通型组治疗前26.69±6.11△7.71△、6.931.31±0.41△5.07△、4.99治疗后20.14±3.89*▲△5.83*、6.34▲1.85±0.50*#△7.73*、6.02#

(续表4-2)

组别时间点IgA(g/L)tIgM(g/L)t对照组1.67±0.460.90±0.34研究组 EV71型组治疗前0.74±0.31△6.83△、5.921.56±0.42△8.07△、5.92治疗后1.21±0.41*△7.02*1.37±0.54*△7.55* CoxA16型组治疗前0.81±0.33△6.38、5.48△1.57±0.49△6.91△治疗后1.63±0.49*#6.07*、5.29#0.92±0.39*#4.62*、8.06# 普通型组治疗前0.79±0.32△6.68△、7.921.57±0.51△9.45△、6.02治疗后1.23±0.42*▲△5.47*、4.88▲1.33±0.41*▲△5.37*、10.04▲

(续表4-3)

组别时间点IgG(g/L)tC3C(g/L)C4(g/L)对照组8.11±2.071.29±0.290.35±0.21研究组 EV71型组治疗前9.31±2.17△8.14△1.17±0.310.30±0.14治疗后8.59±2.091.25±0.320.33±0.21 CoxA16型组治疗前9.43±2.21△7.43△1.21±0.290.33±0.19治疗后8.09±2.10*6.85*1.28±0.310.34±0.23 普通型组治疗前9.26±2.11△9.16△1.23±0.320.31±0.17治疗后8.57±4.091.24±0.280.33±0.21

注：*与治疗前比较P<0.05；#与EV71型组比较P<0.05；▲与CoxA 16组比较P<0.05；△与对照组比较P<0.05。

2.5不良反应情况

治疗后，EV71型组出现不良反应者7例，占14.00%，主要为皮疹3例，斑丘疹1例，头晕2例，注射部位疼痛1例；CoxA 16型组出现不良反应者4例，占7.84%，主要为皮疹2例，腹泻1例，呕吐1例；普通型组出现不良反应者7例，占9.86%，主要为皮疹3例、斑丘疹1例，腹泻2例，心悸1例。各组患者在不良反应发生率方面，差异无统计学意义(χ2=1.07，P>0.05)。

3讨论

3.1 IgA在呼吸系统防御的生理意义

IgG是呼吸系统黏膜重要抗体，IgA是重要的病毒致敏原，对外毒素、病毒具有很好的调理、吞噬作用，而IgM是体液免疫反应早期阶段表达的免疫球蛋白，在机体中的浓度较为稳定，当在病理状态下其浓度有所变化[5]。Tan等[6]的研究表明，手足口病患儿呼吸系统黏膜防御机能下降，导致IgA水平下降，而体内免疫应答早期引起IgM升高。本研究显示，不仅仅EV71型病毒IgA下降、IgM升高，CoxA16型病毒及普通型病毒均是如此，这是机体在病毒入侵时正常的免疫反应。Jung等[7]也认为是T淋巴细胞可以释放多种细胞因子，在肠道感染的免疫应答中发挥着重要作用。正常生理状态下T细胞亚群相互制约，维持机体免疫功能平衡，其中CD4+细胞能够辅助B细胞分泌免疫球蛋白，CD8+则是抑制性细胞。本研究中各组患儿CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、IgA均显著降低，是免疫功能紊乱的直接体现，也是手足口病重症转化的病理学基础。

3.2不同亚型Cox A临床表现分析

导致手足口病的肠道病毒有20多种，其中常见的病原为CoxA16和EV71型。有研究表明，EV71型病毒所致手足口病的临床症状较重，常累及神经系统[8]。在并发神经系统症状的儿童病例中EV71感染率最高(10%～30%)，常见患儿症状为肢体抖动，可能与神经系统特别是脑干受累有关[9]。本研究数据中EV71型患儿出现神经系统症状比例最高，但同其它组别比较差异无统计学意义，可能与入选患儿中年龄较大有关。与EV71型相比较，CoxA16型病毒导致的临床症状较轻，极少出现神经系统症状，同时EV71型病例的收缩压、舒张压、静息心率以及呕吐、肺部感染等情况均比CoxA16型严重[10]。Zhu等[11]研究认为EV71病毒较其他肠道病毒更容易损害T细胞，致使其数量减少，引起细胞免疫功能减弱，造成免疫功能紊乱，细胞免疫功能越弱，病情越易加重，而本研究显示EV71组IgA、CD3+及CD4+均低于CoxA16，再次证明上述假设。

3.3不同药物对免疫功能的影响

热毒宁是第一个采用中药指纹图谱质量标准的中药注射液，由青蒿、栀子、金银花等多味中药材组成，主要有效成分包括青蒿素、绿原酸、栀子苷等，具有疏风解表、清热解毒的功效[12]。现代中药药理研究已经证实具有解暑、解疟、抗病毒、杀菌的作用，同时通过增强中性粒细胞的吞噬能力，有效地抑制了病毒复制，恢复患儿免疫功能[13]。利巴韦林是临床上常用的手足口病的抗病毒药物，重组干扰素α-2b是一种水溶性蛋白质，能够与细胞膜受体结合对病毒DNA、RNA复制产生拮抗作用，两者联合应用能增强T、B淋巴细胞功能，从而提高患儿自身免疫功能，以达到清除病毒的目的[14]。本研究显示，联合治疗5天后，患儿症状显著改善，有效率均在95%以上，其中CoxA16型组患儿的显效率显著高于EV71型组和普通型组，其可能原因有以下几点：①CoxA16型病毒所致的症状较轻，药物干预后患儿能更快改善症状，而EV71型所致症状较重，患儿恢复较慢；②金银花具有显著抑制柯萨奇病毒的作用，而对EV71型病毒的抑制作用相对较弱[15]。

综上所述，EV71型手足口病患儿免疫功能紊乱更为严重，采用重组干扰素α-2b、热毒宁联合利巴韦林治疗后，CoxA 16型病毒患儿免疫功能恢复更快。

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[专业责任编辑：孙 新]

Hand-foot-mouth virus typing and effect of drug intervention on immune function

ZHONG Shao-long

(DepartmentofInfectiousDisease,JieyangPeople’sHospital,GuangdongJieyang522010,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between three kinds of hand-foot-mouth disease (HFMD) virus and immune function and the effect of drug intervention.MethodsTotally 172 children patients with HFMD were divided into enterovirus type 71 (EV71) group, Coxsackie virus A16 (CoxA 16) group and common group according to virus type. Analysis was made on the changes of T lymphocyte subsets, immunoglobulin and complement in cases with different virus type and the changes of these indexes after treatment with Roxynine combined with ribavirin.ResultsCD3+and CD4+of cases at 3A stage in EV71 group and common group were significantly lower than those at 1 and 2 stage (tvalue ranged 5.05-9.03, allP<0.05), but CD8+was significantly higher than that at 1 and 2 stage (tvalue ranged 4.89-8.87, allP<0.05). Significant efficiency of CoxA 16 group was significantly higher than that of EV71 group and common group (χ2value was 5.32 and 6.36, respectively, bothP<0.05). There was no significant difference in total effective rate among three groups (P>0.05). After 5-day treatment, CD3+and CD4+/CD8+in EV71 group were significantly lower than those in CoxA 16 group and common group (tvalue ranged 4.82-6.02, allP<0.05), while IgM was significantly higher than that in CoxA 16 group and common group (tvalue ranged 6.91-10.04,P<0.05). IgA in CoxA 16 group was significantly higher than in EV71 group and common group (tvalue ranged 4.88-5.29, allP<0.05), but CD8+was significantly lower than in EV71 group and common group (tvalue ranged 5.81-7.71, allP<0.05). There was no significant difference in the incidence of adverse reactions among different groups (χ2=1.07,P>0.05).ConclusionImmune dysfunction of children with EV71 type of HFMD is more severe. After treatment with Roxynine combined with ribavirin, immune function of children with CoxA 16 virus restores faster.

hand-foot-mouth disease (HFMD); virus typing; immune function; recombinant human interferon alpha -2b; Roxynine; ribavirin

2016-11-17

钟少龙(1974—)，男，副主住医师，主要从事感染内科临床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.09.012

R725.1

A

1673-5293(2017)09-1074-06