超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱快速测定大米中15种营养成分

朱 丽, 谭 微, 彭祖茂, 邓梦雅, 张协光, 杨国武

(1. 深圳市计量质量检测研究院, 广东 深圳 518109;2. 广西科技大学鹿山学院食品与化学工程系, 广西 柳州 545616)

研究论文

超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱快速测定大米中15种营养成分

朱 丽1*, 谭 微2, 彭祖茂1, 邓梦雅1, 张协光1, 杨国武1

(1. 深圳市计量质量检测研究院, 广东 深圳 518109;2. 广西科技大学鹿山学院食品与化学工程系, 广西 柳州 545616)

建立了超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-LTQ/Orbitrap HRMS)同时快速检测大米中15种营养成分(8种维生素E、6种γ-谷维素及β-胡萝卜素)的方法。样品经过含0.05%(v/v) 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的甲醇溶液超声提取处理后,用Poroshell 120 PFP色谱柱(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)分离,以0.1%(v/v)甲酸水溶液和含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液为流动相,在正离子模式下通过UHPLC-LTQ/Orbitrap HRMS进行全扫描分析。15种营养成分可在13 min内获得满意的分离效果。15种营养成分在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数(r)≥0.995 0, 15种营养成分的检出限(S/N=3)为0.2～1.8 μg/L,定量限(S/N=10)为0.7～6.1 μg/L,在3个添加水平下的平均加标回收率分别为73.2%～101.5%,相对标准偏差(RSD)为1.1%～5.0% (n=3)。该法准确,高效,可靠,适用于大米中多种营养成分的同时测定。

超高效液相色谱;线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱;营养成分;维生素E;γ-谷维素;β-胡萝卜素;大米

大米是人们喜食的主要粮食作物之一,不仅提供人体所需的蛋白质、碳水化合物、粗纤维、维生素、矿物质元素等[1,2],还含有大量对人体有益的生物活性物质,如维生素E(包括生育酚(α-、β-、γ-和δ-tocopherol,α-、β-、γ-和δ-T)和生育三烯酚(α-、β-、γ-和δ-tocotrienols,α-、β-、γ-和δ-T3))、β-胡萝卜素(β-carotene)及γ-谷维素(γ-oryzanol)等[3-6]。维生素E具有抗氧化性,对一些临床疾病有积极的预防作用,如帕金森综合征、艾滋病、胃癌、结肠癌、胰腺癌等[7-9]。γ-谷维素是环木菠萝醇类和甾醇类的阿魏酸酯类物质,米糠、糙米中最常见的γ-谷维素有2,4-亚甲基环木菠萝烯醇阿魏酸酯(2,4-methylencycloartanylferulate)、菜油甾醇阿魏酸酯(campesterylferulate)、β-谷甾醇阿魏酸酯(β-sitosterylferulate)、环木菠萝烯醇阿魏酸酯(cycloartenylferulate)、环木菠萝醇阿魏酸酯(cycloartanylferulate)、菜油烯醇阿魏酸酯(campestanylferulate)。γ-谷维素在抗氧化、抗炎症及调节更年期紊乱方面具有重要作用[4-6,10,11]。β-胡萝卜素能降低某些癌症和慢性病发生的风险[12]。目前关于大米中营养成分研究较多的是水分、灰分、碳水化合物、脂肪、蛋白质、粗纤维和B族维生素等,而维生素E、γ-谷维素和β-胡萝卜素等有机营养成分的研究相对较少。

在检测技术方面,维生素E和γ-谷维素的检测方法主要有分光光度法、高效液相色谱法[12]、高效液相色谱-气相色谱联用法[13]及高效液相色谱-质谱法[14,15];β-胡萝卜素的检测方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法等[12]。但上述方法均不能实现维生素E、γ-谷维素、β-胡萝卜素的同时快速检测。如分光光度法只能测得γ-谷维素的总量[16];液相色谱法只能分离部分γ-谷维素[11],无法准确定性和定量分析常见的γ-谷维素。正相高效液相色谱法能够有效分离维生素E的同分异构体,但其使用的流动相溶剂易挥发，样品分析时间长，实验数据的重复性和稳定性较差[6,17-20]。三重四极杆串联质谱法不能准确定性常见的γ-谷维素[14]。本实验室[21]在这三类营养成分的高通量检测方面取得了一定的研究成果,利用高分辨质谱可有效分离大米中的维生素E、γ-谷维素、磷脂及β-胡萝卜素,并已初步应用于大米指纹图谱库的建立。

本研究在文献[14,21]的基础上,采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱(UHPLC-LTQ/Orbitrap HRMS),建立了检测大米中15种营养成分(8种维生素E、6种γ-谷维素及β-胡萝卜素)的方法。与正相色谱相比,本文采用反相高效液相色谱法,使用的流动相溶剂组成简单、消耗量少,与常规高效液相色谱-质谱法相比,UHPLC-LTQ/Orbitrap HRMS具有高质量分辨率、高质量精密度、高能量碰撞裂解池等特点[22],可有效应用于大米中8种维生素E同分异构体的定性定量分析;可实现普通液相色谱-质谱法无法完成的常见6种γ-谷维素的准确定性定量分析。在大米多种营养成分的准确可靠定量分析方面发挥了重要作用。

1 实验方法

1.1仪器、试剂与材料

超高效液相色谱仪(ACCELA 1250)、液相色谱线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱联用仪(LTQ/Orbitrap XL)(美国Thermo Fisher公司);超声波萃取仪(SK2510LHC,上海科导超声仪器有限公司);涡旋仪(MS3)、空气控温摇床(KS4000ic)(德国IKA公司);分析天平(BAS224S-CW,德国Sartorius公司);碾米机(FT-NMJ-12A,中国中山金富铤科技有限公司);稻谷精米检测机(JGMJ8098,中国上海嘉定粮油仪器有限公司);高通量组织研磨仪(TL2020,北京鼎昊源科技有限公司);检验筛(0.45 mm,浙江上虞市道墟五四仪器纱筛厂)。

甲醇和甲酸(色谱纯,德国Merck公司); 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT,分析纯,美国Sigma-Aldrich公司)。α-T、β-T、γ-T、δ-T标准品(纯度≥98%,美国Supelco公司);α-T3、β-T3、γ-T3、δ-T3标准品(纯度≥98%)和β-胡萝卜素标准品(纯度≥97%)(美国Sigma-Aldrich公司);γ-谷维素标准品(纯度≥98%,加拿大TRC公司),其各自的化学结构式见图1。正离子校正液(Pierce LTQ Velos,美国Thermo Fisher公司)。稻谷分别购自中国东北和泰国。

图 1 15种营养成分的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of the 15 nutrientsα-, β-, γ- and δ-T: α-, β-, γ- and δ-tocopherol; α-, β-, γ- and δ-T3: α-, β-, γ- and δ-tocotrienol.

单标准储备液:分别准确称取所有单标准品,用含0.05%(v/v)BHT的甲醇溶液溶解并定容,配制质量浓度均为1 000 mg/L的单标储备液,于4 ℃避光保存。混合标准工作液:准确量取适量单标准储备液,用含0.05%(v/v)BHT的甲醇溶解并定容,配制所需浓度的混合标准工作液,于4 ℃避光保存。

1.2样品前处理

稻谷经不同程度的碾米、粉碎和过筛，制备得到精米和糙米样品。准确称取0.1 g大米样品,采用经改进的一步甲醇提取法[14,23]进行处理,加入3.0 mL含0.05% (v/v)BHT的甲醇溶液,于室温下超声5 min,然后过0.22 μm有机滤膜,备用。

1.3色谱-质谱条件

色谱柱:Poroshell 120 PFP色谱柱(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱温:25 ℃;流动相:A为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B为含0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液;流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL。梯度洗脱程序:0～1.0 min, 85%B～95%B; 1.0～7.0 min, 95%B～98%B; 7.0～12.5 min, 98%B～100%B; 12.5～13.0 min, 85%B。

离子源:大气压化学离子(APCI)源;扫描方式:正离子扫描;离子源温度:400 ℃;离子传输管温度:270 ℃;喷雾电压:2.5 kV;鞘气(N2)压力:345 kPa;辅助气(N2)流量:1.7 L/min;质量校正:外标法;一级质谱:扫描范围m/z100～1 000,扫描分辨率30 000;二级质谱:扫描范围m/z50～800,碎裂方式为高能量碰撞(CID),碰撞能量为35 eV。15种营养成分的其他质谱参数见表1。

1.4数据分析

液相色谱-质谱数据经过Thermo Xcalibur V 2.1软件进行检测分析;离子碎片结构计算和数据处理采用NIST MS V 2.0和Mass Frontier V 5.0软件。

2 结果与讨论

2.1提取方式的优化

本实验采用一步甲醇提取法对大米样品中的营养成分进行提取,为了获得较好的提取效率,本文考察了超声、振荡及涡旋3种提取方式对提取效率的影响(见图2)。结果表明,采用超声方式提取时15种营养成分的回收率最高,为78.5%～96.8%,提取效果最佳,因此选为实验所用。

表 1 15种营养成分的分子式、保留时间、相对分子质量(Mr)和其他质谱参数Table 1 Formulas, retention times (tR), relative molecular masses (Mr) and other MS parameters of the 15 nutrients

图 2 不同提取方式对15种营养成分回收率的影响(n=6)Fig. 2 Effects of different extraction modes on the recoveries of the 15 nutritients (n=6)

2.2色谱柱与流动相的选择

本文分别考察了Hypersil gold C18柱(100 mm×2.1mm, 1.9 μm)和Poroshell 120 PFP柱(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)对15种营养成分分离情况的影响。研究发现,Hypersil gold C18柱不能有效分离8种维生素E,而Poroshell 120 PFP柱可有效分离8种维生素E(见图3)。

图 3 不同色谱柱对15种营养成分分离的影响Fig. 3 Effects of different chromatographic columns on the separation of the 15 nutrientsPeaks 1-15 were the same as in Table 1.

本文考察了不同的流动相(10 mmol/L乙酸铵-甲醇、10 mmol/L甲酸铵-甲醇、0.1%(v/v)乙酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液和0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液)对目标物分离效果的影响。研究发现,采用10 mmol/L乙酸铵-甲醇和10 mmol/L甲酸铵-甲醇洗脱时均不能有效分离15种营养物质;采用0.1%(v/v)乙酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液作为流动相时部分目标物峰面积的稳定性较差;采用0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1%(v/v)甲酸的甲醇溶液作为流动相时15种营养成分的色谱峰无明显拖尾,能够在13 min内达到有效分离(见图4),满足分析要求。因此实验选择0.1%(v/v)甲酸水溶液-0.1% (v/v)甲酸的甲醇溶液为流动相。

图 4 15种营养成分的提取离子色谱图Fig. 4 Extracted ion chromatograms of the 15 nutrientsPeaks 1-15 were the same as in Table 1.

2.3质谱条件的优化

本实验考察了电喷雾离子源和APCI源对15种营养成分离子化效应的影响。研究发现,在电喷雾离子源下,8种维生素E和β-胡萝卜素不能被有效离子化,而APCI源对脂溶性成分有较好的离子化作用。因此选取APCI源作为最终的离子源。

碰撞裂解能量是优化离子碎片裂解的重要参数。实验考察不同的CID值(25、35和45 eV)对目标物碎片裂解情况的影响。实验数据表明,当CID值为25 eV和45 eV时,背景噪声较多,而且25 eV时不能获得全面的离子碎片；当CID值为35 eV时，可解决上述问题。因此本实验将CID值设为35 eV。

在结构上生育酚和生育三烯酚均含有苯并二氢吡喃环骨架,不同的是生育酚具有饱和的侧链,而生育三烯酚的侧链是不饱和的。生育酚和生育三烯酚具有相同的裂解途径,通过侧链不同位置的裂解,母离子[M+H]+可产生3种不同的离子碎片。在大气压化学离子源条件下,γ-谷维素容易失去一个阿魏酸分子(m/z194),从而形成[M-C10H10O4+H]+的分子离子峰。β-胡萝卜素(m/z537)具有对称的结构,能够生成3种主要的产物离子,m/z分别为480、440和412,而且比较容易在结构中间形成一个三元环。因此在本实验的质谱条件下可探究大米中生育酚、生育三烯酚、γ-谷维素及β-胡萝卜素的裂解途径与机制。

2.4基质效应

基质效应(ME)是指目标物以外的其他组分对目标物测定值的影响,包括基质抑制和基质增强两种效应。基质效应会影响定量结果的准确性,因此评价基质效应是十分必要的。本实验选取精米和糙米两种样品考察基质效应。将大米样品置于100 ℃烘箱过夜后,光照24 h，备用。采用基质提取液和甲醇分别配制系列标准溶液，并绘制标准曲线,比较两条标准曲线的斜率,ME[24-26]=基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率,离子抑制率(ion suppression)=(1-ME)×100%。15种营养成分的离子抑制率分布图见图5。结果表明,两种基质中的离子抑制率均大于0,表现为基质抑制效应。这可能是因为大米中含有一定量的磷脂类物质,这种内源性组分对大气压化学电离会产生离子抑制作用,使15种营养成分均表现为离子抑制。两种大米基质中仅约6.7%的样品的离子抑制率大于15%,说明本实验中的离子抑制作用并不明显,实验结果可接受。

图 5 15种营养物离子抑制率的分布图Fig. 5 Distribution of ion suppressions of the 15 nutrients

CompoundLinearrange/(mg/L)LinearequationrLOD/(μg/L)LOQ/(μg/L)α-T0.05-10y=143.40x+26.510.99730.82.7β-T0.05-10y=288.83x+44.510.99751.86.1γ-T0.05-10y=377.11x+67.220.99741.24.0δ-T0.05-10y=526.55x-10.680.99791.13.7α-T30.05-10y=203.51x+32.320.99760.72.3β-T30.05-10y=141.17x+17.360.99810.62.0γ-T30.05-10y=207.13x+30.850.99810.41.3δ-T30.05-10y=198.11x+44.010.99730.62.0Cycloartenylferulate0.10-10y=254.24x+26.160.99670.31.02,4-Methylencycloartanylferulate0.10-10y=257.69x+21.540.99730.31.0Campesterylferulate0.01-10y=261.21x+81.690.99730.31.0β-Sitosterylferulate0.01-10y=254.83x+32.980.99870.31.0Cycloartanylferulate0.01-10y=234.23x+5.810.99780.20.7Campestanylferulate0.01-10y=235.69x-16.910.99760.31.0β-Carotene0.05-10y=180.20x+146.070.99501.03.3

y: peak area of the analyte;x: mass concentration, mg/L.

2.5方法学验证

2.5.1线性范围、检出限和定量限

15种目标化合物的线性范围、线性方程、相关系数(r)、检出限(LOD)、定量限(LOQ)见表2。15种目标物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数均≥0.995 0。检出限和定量限分别以3倍和10倍信噪比(S/N)计算,结果分别为0.2～1.8 μg/L和0.7～6.1 μg/L。该方法检出限和定量限比文献[14]报道的值更低,灵敏度较高。

2.5.2回收率和精密度

分别向东北精米样品中添加低、中、高3个水平(工作曲线最低点的质量浓度、0.5 mg/L和2.5 mg/L)的单标准工作液(单标准储备液经含0.05%(v/v)BHT的甲醇溶液稀释得到),测试样品的加标回收率,每个水平平行3份(见表3)。结果表明，15种营养成分的平均加标回收率为73.2%～101.5%, RSD为1.1%～5.0% (n=3)。

2.5.3稳定性

为考察仪器的稳定性,取工作曲线中间浓度的标准溶液,同等条件下测定6次,分别计算保留时间和峰面积的RSD。结果表明，各营养成分在仪器上保留时间的RSD均小于0.6%;峰面积的RSD均小于10%。

糙米样品经含0.05% (v/v)BHT的甲醇提取,过滤膜后,于4 ℃避光保存,并分别于0、4、8、12、36和48 h进样分析,考察样品中8种维生素E、6种γ-谷维素及β-胡萝卜素的稳定性(见图6)。结果表明，样品中各营养成分在48 h内峰面积的RSD为1.8%～9.3% (n=3)，稳定性良好。

2.6实际样品测定

将购买的东北稻谷和泰国稻谷进行前处理,制备精米和糙米，并对其中的15种营养成分进行定量分析,具体结果见表4。由表4可知,糙米中α-生育酚、α-、β-及δ-生育三烯酚的含量明显高于精米中相应营养成分的含量。糙米中γ-谷维素的含量较高,而精米中几乎未检出。只有泰国糙米中含有一定量的β-胡萝卜素,其他均未检出β-胡萝卜素。研究表明,糙米中营养成分的含量要明显高于精米中相应营养成分的含量,这可能是因为随着大米加工精度的提高,其中的营养物质也有所流失。

表 3 15种营养成分的加标回收率和相对标准偏差(n=3)Table 3 Recoveries and RSDs of the 15 spiked nutrients (n=3)

图 6 样品前处理后不同存放时间对大米样品中15种营养成分峰面积的影响(n=6)Fig. 6 Effects of different storage times on the peak areas of the 15 nutrients in rice samples after pretreatment (n=6)

μg/g

表 4 (续)Table 4 (Continued)

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱同时快速检测大米中15种营养成分的分析方法。该法可有效用于鉴别和定量检测大米中8种维生素E、6种γ-谷维素及β-胡萝卜素。该法准确、高效、可靠,适用于大米中多种营养成分的同时测定。本文初步探讨了碾米程度对大米中15种营养成分含量的影响,为后期深入研究加工方式对大米中营养成分的变化奠定了基础。

[1] Thammapat P, Meesoaret N, Siriamornpun S. Food Chem, 2016, 194(5): 230

[2] Qian L L, Song C L, Li Z J, et al. Food Science and Technology, 2015, 36(12): 129

钱丽丽, 宋春蕾, 李志江, 等. 食品科技, 2015, 36(12): 129

[3] Slavin J. Nutr Res Rev, 2004, 17(1): 99

[4] Goufo P, Trindade H. Food Sci Nutr, 2014, 2(2): 75

[5] Aladedunye F, Przybylski R, Rudzinska M, et al. J Am Oil Chem Soc, 2013, 90(8): 1101

[6] Huang S H, Ng L T. J Chromatogr A, 2011, 1218(29): 4709

[7] Allard J P, Aghdassi E, Chau J, et al. Aids, 1998, 12(13): 1653

[8] The Parkinson Study Group. New Eng J Med, 1993, 328(3): 176

[9] Nikiforova N V, Kirpatovsky V I, Darenkov A F, et al. Nephron, 1995, 69(4): 449

[10] Azrina A, Maznah I, Azizah A H, et al. ASEAN Food J, 2008, 15(1): 89

[11] Chen Y F, Jin J, Zheng S W, et al. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association, 2014, 29(7): 112

陈燕飞, 金俊, 郑苏卫, 等. 中国粮油学报, 2014, 29(7): 112

[12] Stoggl W, Huck C, Wongyai S, et al. J Sep Sci, 2005, 28(14): 1712

[13] Miller A, Frenzel T, Schmarr H G, et al. J Chromatogr A, 2003, 985(1/2): 403

[14] Shammugasamy B, Ramakrishnan Y, Manan F, et al. Food Anal Methods, 2015, 8(3): 649

[15] Fang N, Yu S G, Badger T M, et al. J Agric Food Chem, 2003, 51(11): 3260

[16] Fan G X, Sun X W, Pan X R. Science and Technology of Cereals, Oils and Foods, 2010, 18(1): 20

范国欣, 孙晓薇, 潘希荣. 粮油食品科技, 2010, 18(1): 20

[17] Nielsen M M, Hansen A, et al. Cereal Chem, 2008, 85(2): 248

[18] Kamal-Eldin A, Gorgen S, Pettersson J, et al. J Chromatogr A, 2000, 881(1/2): 217

[19] Heinemann R J B, Xu Z M, Godber J S, et al. Cereal Chem, 2008, 85(2): 243

[20] Ruperez F J, Martin D, Barbas H E, et al. J Chromatogr A, 2001, 935 (1/2): 45

[21] Zhu L, Yang S T, Li G K, et al. Anal Method, 2016, 8: 5628

[22] Helfer A G, Michely J A, Weber A A, et al. Anal Chim Acta, 2015, 891(37): 221

[23] Chen M H, Bergman C J. J Food Compos Anal, 2005, 18(4): 319

[24] Matuszewski B K, Constanzer M L, Chavez-Eng C M. Anal Chem, 2003, 75(13): 3019

[25] Farre M, Pico Y, Barcelo D. J Chromatogr A, 2014, 1328: 66

[26] Liu Y Q, Li K, Xu W J, et al. Journal of Chinese Chromatography, 2016, 34(11): 1055

刘永强, 李凯, 许文娟, 等. 色谱, 2016, 34 (11): 1055

Rapid determination of15nutrients in rice by ultra high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry

ZHU Li1*, TAN Wei2, PENG Zumao1, DENG Mengya1, ZHANG Xieguang1, YANG Guowu1

(1. Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection, Shenzhen 518109, China;2. Department of Food and Chemical Engineering, Lushan College of Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou 545616, China)

A rapid method was developed for the simultaneous determination of 15 nutrients containing eight vitamin E, sixγ-oryzanols andβ-carotene in rice by ultra high performance liquid chromatography-linear ion trap/orbitrap high resolution mass spectrometry (UHPLC-LTQ/Orbitrap HRMS). The analytes were extracted by methanol containing 0.05% (v/v) 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) under the ultrasonic condition, then separated by a Poroshell 120 PFP column (150 mm×3.0 mm, 2.7 μm) with a gradient elution program using 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and methanol containing 0.1% (v/v) formic acid as mobile phases. The detection was performed using an LTQ/Orbitrap HRMS detector with full scan in positive ion mode. Fifteen nutrients were simultaneously separated within 13 min. Furthermore, matrix effects of the white and brown rices were investigated. The correlation coefficients (r) were≥0.995 0 in the linear ranges of the 15 nutrients. The limits of detection (LODs,S/N=3) and limits of quantification (LOQs,S/N=10) of the 15 nutrients were 0.2-1.8 μg/L and 0.7-6.1 μg/L, respectively. At the three spiked levels, the recoveries were 73.2%-101.5% with the relative standard deviations (RSDs) ranging from 1.1% to 5.0% (n=3). The method is accurate, efficient and reliable. It is suitable for the simultaneous determination of various nutrients in rice.

ultra high performance liquid chromatography (UHPLC); linear ion trap-orbitrap high resolution mass spectrometer (LTQ/Orbitrap HRMS); nutrients; vitamin E;γ-oryzanol;β-carotene; rice

10.3724/SP.J.1123.2017.05001

2017-05-04

.Tel:(0755)27528545,E-mail:foodtestzl@126.com.

广东省质量技术监督局科技项目(2017CZ12).

O658

A

1000-8713(2017)09-0949-08

Foundation item: Administration of Quality and Technology Supervision of Guangdong Province Project (No. 2017CZ12).

*