野生麻花秦艽中龙胆苦苷和黄酮对牧草的化感作用及抗氧化性研究

2017-09-14丁春发魏小红

草地学报 2017年1期

丁春发，魏小红

（甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070）

麻花秦艽（G.stramineaMaxim.）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gen-tiana）秦艽组（Sect.CruciataGaudin）多年生草本植物，花中黄酮类物质含量较高，其根是我国重要的常用中药材之一，已被列入国家三级保护药材行列［1］，活性成分主要是龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷，其中龙胆苦苷具有多方面的药理作用［1］。随着中药材市场需求的不断扩大，药用植物人工栽培种类和规模也在不断增加。在栽培的药用植物中，根类药材占70%左右，生产中绝大多数根类药材会产生连作障碍，连作障碍已成为制约我国中药材可持续发展的重大问题；连作使得土壤细菌群落结构多样性急剧下降，微生物种类减少，病原菌增多，严重影响到微生态环境的稳定性，造成土壤质量退化和土壤污染，这也是造成药用植物栽培过程中质量和产量下降的一种重要因素［2］。

研究发现，药用植物连作障碍与其产生的化感物质密切相关［3］，化感作用是植物争夺土壤中的养分、空间及竞争生态位而形成的对外界环境的一种适应机制［4］。大多数药用植物可以向环境中释放次生代谢产物即化感物质对周围植物起作用［5］，龙胆苦苷和黄酮不仅是主要的化感物质，而且是中草药中主要的活性成分和抗氧化物［6-7］；豆科牧草轮作能使土壤微生物群落复杂程度显著增加，大幅度改良土壤质量，且改良效果随豆科植物品种不同、连作年限长短而存在差异［8-11］。对于秦艽的研究前人已在其药用成分、药理与栽培方面做了大量工作，但其主要的次生产物龙胆苦苷和黄酮的化感作用及其抗氧化性还鲜有报道。本文分别以麻花秦艽根、花为原料，利用超声提取法对龙胆苦苷和黄酮进行提取，通过龙胆苦苷和黄酮对受体植物种子萌发及胚根生长的影响、活性氧和自由基清除能力的研究揭示其化感作用及其抗氧化性，建立麻花秦艽和豆科牧草之间的轮作、间作和套作体系，缓解或解除麻花秦艽栽培过程中的连作障碍，从而为麻花秦艽的人工栽培和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集地自然概况和受体植物

野生麻花秦艽采集于天祝藏族自治县金强河封育多年的天然草地，其位于甘肃省中部，祁连山东端，地处青藏、黄土、内蒙古三大高原交汇过渡地段，海拔2500～3200m，该地区气候湿润，年平均气温-1℃～1.3℃，年降水量265～600mm，全年日照时数2500～2700h，气候属典型的大陆性高原季风气候，植被生长季90～145d。

麻花秦艽属于多年生的药用植物，秋季时节其花和叶成熟，2015年9月采集生长期达3年以上且根、叶、花完整的植株，洗净，将其根、花分离后自然风干，粉碎机粉碎过0.45mm筛后贮藏备用。

受体植物：紫花苜蓿（‘阿尔冈金’）和红三叶（‘Marathon’）都属于优良豆科牧草，二者在甘肃境内多有分布，其种子购于甘肃省农科院。

1.2 试验方法

1.2.1 野生麻花秦艽龙胆苦苷提取液和黄酮提取液的制备参照康辉等［12］的方法：称取干燥的野生麻花秦艽根粉末5g，按照料液比1∶30的比例加入150mL蒸馏水，利用超声提取法，在40℃下提取40 min，然后用离心机在3500r·min-1离心5min，合并上清液并用蒸馏水定容至150mL，吸取少量在273nm处测定其吸光值，代入标准曲线方程，求得龙胆苦苷提取液的浓度为12.60mg·mL-1，按不同倍数稀释得到6.30，2.52，1.26，0.63mg·mL-1的龙胆苦苷稀释液，备用。

参照康辉和杜芳艳等［12-13］的方法：称取干燥的野生麻花秦艽花粉末5g，按照料液比1∶40的比例加入200mL 60%乙醇，在最大超声频率下，于65℃超声处理20min后，冷却过滤，滤渣重复提取两次，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至50mL，按1∶1比例加入石油醚除去脂溶性物质和叶绿素等，回收石油醚，下层粗提液转入150mL三角瓶中，用蒸馏水定容至刻度，吸取少量在510nm处测定其吸光值，代入标准曲线方程，求得黄酮提取液的浓度为3.90mg·mL-1，按不同倍数稀释得到1.95，0.78，0.39，0.195mg·mL-1的黄酮稀释液，备用。

1.2.2 种子发芽及胚根生长试验采用培养皿滤纸法［14］：试验于2015年12月在甘肃农业大学生命科学技术学院植物生理实验室进行，挑选饱满、均匀、大小一致的红三叶和紫花苜蓿种子，用0.1%HgCl2溶液消毒3～5min，无菌蒸馏水对消毒后的种子反复多次冲洗后均匀置于预先处理过的培养皿中，每皿50粒，每个培养皿分别加入不同浓度麻花秦艽龙胆苦苷或者黄酮提取液5mL，对照加入5 mL无菌蒸馏水，每个处理组3次重复。然后分别置于（21±2）℃、（28±2）℃恒温光照培养箱内，在12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，整个培养过程中确保加湿器正常工作。于每天早上8：00统计种子发芽数，统计试验结束的标记是以连续3d不再有受体植物种子发芽，计算种子最终发芽率、发芽势（4d）和发芽指数［15］，7d时测定发芽种子的胚根长度。

发芽率（GP）=7d发芽种子数/测试种子总数×100%［16］

发芽势（GE）=前3d发芽种子数/种子总数×100%［16-17］

发芽指数（GI）=∑（Gt/Dt）［18］（式中，Dt为日发芽种子数，Gt为与Dt相应的每天的发芽种子数。）

化感效应指数RI=1-C/T（T≥C），或者RI=C/T-1（T＜C）（式中，C为对照发芽率，T为处理发芽率。RI表示化感作用强度大小，正值表示促进，负值表示抑制，绝对值大小反映化感作用的强弱［19］。）

1.2.3 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮提取液对羟自由基（.OH）清除能力测定 Fenton反应体系的建立［20］：取若干个具塞试管，依次加入0.006mmol·mL-1的FeSO4溶液2mL，然后于不同试管中依次加入12.60，6.30，2.52，1.26，0.63mol·mL-1龙胆苦苷提取液2mL，再依次加入0.006mmol·mL-1的H2O2溶液2mL，摇匀静置10min，最后加入0.006mmol·mL-1的水杨酸-乙醇溶液2mL，摇匀，37℃恒温水浴15min，在536nm处测定吸光值Ai；用蒸馏水代替水杨酸-乙醇溶液，其他同上，在536nm处测定吸光值Aj，用以排除样品本身的颜色干扰；用蒸馏水代替龙胆苦苷提取液，其他同上，测定其吸光值A0。

用3.90，1.95，0.78，0.39，0.195mg·mL-1的黄酮提取液替换龙胆苦苷提取液，测量黄酮提取液对羟自由基（OH.）清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/A0］＊100

1.2.4 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮提取液对超氧阴离子（O-.2）清除能力测定邻苯三酚反应体系的建立［21］：取若干个具塞试管，依次加入0.05 mmol·mL-1Tris-HCl（pH=8.20）缓冲液5mL，与不同试管中依次加入不同浓度龙胆苦苷提取液0.2mL，25℃恒温水浴10min，再依次加入0.1mL经25℃预热过的0.006mmol·mL-1邻苯三酚溶液，快速摇匀于25℃恒温水浴5min，最后加入1 mL 0.01mmol·mL-1HCl终止反应，在510nm处测定吸光值Ai；用0.01mmol·mL-1HCl代替邻苯三酚溶液，其他同上，在510nm处测定吸光值Aj，用以排除样品本身的颜色干扰；用蒸馏水代替龙胆苦苷提取液，其他同上，测定其吸光值A0。

用不同浓度的黄酮提取液替换龙胆苦苷提取液，测量黄酮提取液对超氧阴离子（O-.2）的清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/A0］＊100

1.2.5 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮提取液对二苯苦味酰肼自由基（DPPH.）清除能力测定参照张志国［22］等的方法：取若干个具塞试管，依次加入0.0002mmol·mL-1DPPH-乙醇溶液2mL，再分别加入不同浓度的龙胆苦苷提取液2mL，震荡摇匀静置30min后，在517nm处测定吸光值Ai；取若干个具塞试管，在不同试管中先分别加入不同浓度的龙胆苦苷提取液2mL，再依次加入95%乙醇溶液2mL，震荡摇匀静置30min后，在517nm处测定吸光值Aj；于具塞试管依次加入2mL 0.0002 mmol·mL-1DPPH-乙醇溶液，2mL 95%乙醇溶液，震荡摇匀静置30min后，在517nm处测定吸光值AC。

用不同浓度的黄酮提取液替换龙胆苦苷提取液，测量黄酮提取液对DPPH.的清除率。

清除率/%=［1-（Ai-Aj）/AC］＊100

1.2.6 数据分析各项试验均重复3次，所得数据用Excel 2010软件求得平均值和标准误，采用SPSS软件对不同处理进行单因素方差分析，采用Duncan检验法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮提取液对红三叶和紫花苜蓿种子发芽的影响

由表1、表2可知，不同浓度的龙胆苦苷提取液对红三叶和紫花苜蓿种子的萌发都有不同程度的抑制作用，抑制作用强弱与浓度大小呈正相关，与对照差异显著（P＜0.05）。从总体上看，同浓度下龙胆苦苷提取液对红三叶发芽率（G）、发芽势（GE）和发芽指数（GI）的化感效应小于紫花苜蓿。同样，不同浓度的黄酮提取液对红三叶和紫花苜蓿种子的萌发也有不同程度的抑制作用，相比较而言，黄酮提取液浓度为0.78mg·mL-1时对红三叶发芽率、发芽势和发芽指数的化感指数大于紫花苜蓿，而浓度为1.95和3.90mg·mL-1时，对紫花苜蓿发芽率、发芽势和发芽指数的化感指数大于红三叶。

表1 野生麻花秦艽龙胆苦苷提取液对红三叶和紫花苜蓿种子发芽的影响Table 1 Effects of aqueous extracts of gentiopicroside from Feral G.straminea Maxim.on seed germination of Trifolium pratense and Medicago sativa

表2 野生麻花秦艽黄酮提取液对红三叶和紫花苜蓿种子发芽的影响Table 2 Effects of aqueous extracts of flavones from Feral G.straminea Maxim.on seed germination of Trifolium pratense and Medicago sativa

2.2 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮提取液对红三叶和紫花苜蓿胚根生长的影响

由图1、图2可知：不同浓度的龙胆苦苷提取液对红三叶和紫花苜蓿的胚根都表现出抑制作用且与对照差异显著（P＜0.05）。浓度越大，抑制作用越明显，总体呈正比关系，但浓度从2.52mg·mL-1增大到6.30mg·mL-1时，其抑制作用增强更明显。由于不同植物胚根生长发育的内部条件不同，因此不能说明龙胆苦苷提取液对哪种植物胚根的生长抑制作用更明显。同样，不同浓度的黄铜提取液对红三叶和紫花苜蓿的胚根也表现出不同程度的抑制作用且与对照差异显著（P＜0.05）。浓度越大，抑制作用越明显，浓度为3.90和1.95mg·mL-1时，对红三叶胚根的抑制作用不显著。

2.3 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮对羟自由基（.OH）清除能力

不同浓度的龙胆苦苷提取液对羟自由基都有一定的清除能力，浓度较低时，随浓度增大，清除率逐渐增大，当浓度为2.52mg·mL-1时，对.OH的清除率最大，达到83.06%，随浓度继续增大，清除率逐渐降低且浓度为1.26和0.63mg·mL-1时差异不显著（图3）。而黄酮提取液对·OH的清除率与龙胆苦苷提取液不同，浓度偏低时，随浓度增加，清除率逐渐增大，浓度为1.95mg·mL-1时，清除率达最大值98.55%，随浓度继续增加，清除率降低，浓度为0.39mg·mL-1时与3.90，0.78及0.195 mg·mL-1之间差异都不显著（图4）。

图1 不同浓度野生麻花秦艽龙胆苦苷提取液对红三叶和紫花苜蓿胚根长的影响Fig.1Radicle length of Trifolium pratense and Medicago sativa treated with different concentration of gentiopicroside extracts from Feral G.straminea Maxim.

图2 不同浓度野生麻花秦艽黄酮提取液对红三叶和紫花苜蓿胚根长的影响Fig.2 Radical length of Trifolium pratense and Medicago sativa treated with different concentration of flavones extracts from Feral G.straminea Maxim.

2.4 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮对超氧阴离子（O-.2 ）清除能力

不同龙胆苦苷浓度对O-.2的清除率不同，浓度为1.26mg.mL-1时，清除率最大，达到55.32%，随龙胆苦苷浓度持续增加，清除率下降，并且波动范围很小且与其他浓度之间差异显著（P＜0.05）（图3）。黄酮提取液对O-.2的清除率表现为浓度低时，清除率较高，当浓度大于0.39mg·mL-1时，随浓度增大，清除率逐渐减小，3.90和1.95及0.39和0.195 mg·mL-1间差异都不显著（图4）。

2.5 野生麻花秦艽龙胆苦苷和黄酮对二苯苦味酰肼自由基（DPPH.）清除能力

不同浓度的龙胆苦苷提取液对DPPH.的清除能力不同，浓度为0.63mg·mL-1时，清除率最小，仅为54.25%，浓度为2.52mg·mL-1时，清除率达到最大值88.30%，之后随浓度增加清除率下降且达到稳定，12.60与6.30mg·mL-1间差异不显著，与其他浓度间差异显著（P＜0.05）（图3）。黄酮对DPPH.的清除率表现出浓度较低时，随浓度增加清除率逐渐增大，浓度为1.95mg·mL-1时清除率达最大值95.59%，随后清除率随浓度增加而下降，浓度为3.90mg·mL-1时清除率仅为76.47%，浓度为0.39mg·mL-1时，与3.90和0.78及0.195mg·mL-1之间差异都不显著（图4）。

图3 不同浓度野生麻花秦艽龙胆苦苷提取液的清除率Fig.3 Clearance rate of different concentration of gentiopicroside extracts from Feral G.straminea Maxim.

图4 不同浓度野生麻花秦艽黄酮提取液的清除率Fig.4 Clearance rate of different concentration of flavones extracts from Feral G.straminea Maxim.

3 讨论

种子萌发对物种更新至关重要，种子的成功发芽决定着植物种群的生存和繁衍［23］，而种子发芽容易受环境胁迫的影响，被认为是植物生活周期中最重要和最脆弱的阶段［23］。种子发芽率、发芽势和发芽指数均可反映种子发芽能力，发芽率与种子生活力是一致的，发芽指数反映了种子发芽的速率和整齐程度［24］。一般而言，环境胁迫作用越强，对种子发芽过程中产生的抑制作用也越强，但同一种胁迫作用对不同植物种子发芽产生的抑制作用表现出差异性［25-26］。种子的发芽受内源抑制物［27］和化感物质的影响，化感物质可以降低种子发芽率并延缓种子发芽时间［28］。本研究中，两种受体植物紫花苜蓿和红三叶种子经龙胆苦苷和黄酮提取液处理后，其发芽率显著降低，且随浓度增加，抑制作用逐渐增强；同时，随提取液浓度增大，受体植物种子发芽指数下降，发芽时间延长。化感活性物质能够影响种子内部物质代谢及各种代谢关键酶的活性，引起种子劣变，使种子活力降低，进而使得发芽率降低，延迟发芽时间［28-29］；两种受体植物对同一浓度的龙胆苦苷或黄酮提取液的胁迫效应表现出明显的不一致性，且在低浓度条件下，这种差异性更为明显：同浓度下龙胆苦苷提取液对红三叶发芽率、发芽势和发芽指数的化感效应小于紫花苜蓿，说明龙胆苦苷对紫花苜蓿的化感抑制作用要强于红三叶。相比较而言，黄酮提取液浓度为0.78mg·mL-1时对红三叶发芽率、发芽势和发芽指数的化感指数大于紫花苜蓿，而浓度为1.95和3.90mg·mL-1时，对紫花苜蓿发芽率、发芽势和发芽指数的化感指数大于红三叶，可能是由于二者种子的物质组成和结构不同，在萌发过程中，化感物质对其基本代谢过程和生长调节系统的胁迫影响也不同，说明化感作用不仅与受体植物种类有关，与供体植物本身也有关联［30］。由于龙胆苦苷和黄酮提取液对红三叶的抑制作用相对较弱，在秦艽的栽培过程中可以作为轮作、间作或套作植物进行倒茬，缓解其连作障碍。

近年来，国内外越来越多的学者对药用植物的自毒作用及化感作用进行了研究［13，31-39］。在自然生态系统中，当化感物质在土壤中积累到一定量后，就会延缓植物的发芽时间、降低植物的发芽率，进而影响植物的生长发育［39］，但是，化感物质起作用需要达到一定的浓度，在自然条件下，外来植物向土壤中释放的化感物质浓度只有达到了某一有效作用阈值，才会对周围的伴生植物产生抑制效果［40］。化感物质能影响细胞分裂，细胞伸长和根尖的细微结构，对植物的幼根有促进或者抑制作用［41-42］。本研究证明，秦艽中龙胆苦苷和黄酮提取液对受体植物紫花苜蓿和红三叶的种子萌发和胚根的生长都有不同程度的影响且都表现出抑制作用，随着浓度增大抑制作用逐渐增强；相同浓度的龙胆苦苷和黄铜提取液对紫花苜蓿和红三叶的发芽抑制和胚根生长的抑制作用不同，说明不同植物对化感胁迫的敏感性表现出差异性。化感物质可以通过茎叶挥发、根系分泌、雨露淋洗和植物残体腐解等方式释放到外界环境中［43-45］，化感物质进入土壤后，在到达目标植物之前，要经过土壤颗粒和土壤微生物的吸附、运输、转化甚至降解，其结构、有效性和活性均会发生复杂的变化，导致对受试植物的化感效应出现相应变化［46］。药用植物根系分泌物的化感自毒作用［46］、根系分泌物对生态效应的间接作用及土壤微生物区系紊乱是导致植物连作障碍的主要因素［47-48］。龙胆苦苷和黄酮作为药用植物麻花秦艽的活性成分，其可能通过特定方式释放到自然生态系统中，对自身的连作产生不良效应、对伴生植物及轮作作物的发芽和生长产生抑制和毒害。

自由基是机体代谢过程中产生的中间产物，其参与的很多反应对机体是有益的，但是，在某些病理状态下，机体可能产生大量高反应活性的氧自由基［49］。自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病等的重要因素［50-52］。超氧阴离子可以反应生成其他的氧自由基［53］；羟基自由基可以破坏蛋白质、膜脂、糖类、核酸等生物大分子的空间结构，使其丧失生物学功能［54］。但生物体内存在抗氧化酶和抗氧化剂如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（POD）等自由基清除体系［51］，另外黄酮、多酚、多糖类、环烯醚萜苷等化合物能调节和提高体内抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px等）的活性［55］，使得机体内氧自由基的产生和清除处于一种动态平衡；抗氧化剂或抗氧化酶单独作用时，对自由基的清除能力要弱于共同作用时的清除能力，可能是二者的协同作用，提高了抗氧化酶的活性，增强了对自由基的清除能力［56］，因此，生物体内自由基的清除是多种因素共同作用的结果；DPPH·是以DPPH·自由基和DPPH·+两种平衡态存在，抗氧化剂通过递电子、递质子清除DPPH·自由基或者使DPPH·自由基生成DPPH2最终分解成三硝基苯胺使其清除［57］。本研究表明，秦艽中不同浓度的龙胆苦苷和黄酮提取液对羟自由基（·OH）、超氧阴离子（O-2·）、二苯苦味酰肼自由基（DPPH·）均有较强的清除能力，且不同浓度的龙胆苦苷和黄铜提取液对三种自由基的清除能力有较大差异。已有研究证明，动物体内黄酮类物质可以直接捕捉和清除自由基，也能调节和提高抗氧化酶活性［58］，植物体内的黄酮类物质是不是通过这种途径达到清除自由基的作用、麻花秦艽中的龙胆苦苷对自由基清除作用的机理是否也和黄酮一样通过捕捉活泼的自由基或者通过抑制自由基引发剂达到抗氧化的目的，需进一步研究证实。

本试验研究了中草药麻花秦艽中龙胆苦苷和黄酮提取液的化感作用，结果表明二者对受体植物紫花苜蓿和红三叶的种子萌发和胚根生长均表现出不同程度的抑制作用，且抑制作用与提取液浓度大小呈正比关系，已有研究证明黄酮能够调节和激活抗氧化酶的活性，这可能是其对受体植物表现出化感作用的调节机制，龙胆苦苷与黄酮是否有相同的作用机制还需进一步研究。此研究为建立麻花秦艽与作物之间的轮作、间作及套作体系进而缓解并解除麻花秦艽栽培过程中的连作障碍，为药用植物麻花秦艽的合理栽培提供一定的理论依据，为充分利用这一药用植物资源奠定基础。