HPLC法测定肝康宁颗粒中绿原酸的含量

国宏伟

山东省济宁市第一人民医院药学部，山东济宁 272011

HPLC法测定肝康宁颗粒中绿原酸的含量

国宏伟

山东省济宁市第一人民医院药学部，山东济宁 272011

目的 建立肝康宁颗粒中绿原酸含量的合理有效稳定的测定方法。方法 采用高效液相色谱法测定绿原酸的含量。色谱柱:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相：乙腈-2%醋酸溶液（13:87）。流速：1 mL/min,测定波长 327 nm。结果 绿原酸在0.32～1.93 μg范围线性相关良好，相关系数(r=0.999 8)，回归方程为Y=1 025 887X-65 235,平均回收率99.06%(RSD=1.10%,n=6)。精密度RSD=0.61%(n=6),重复性RSD=0.56%(n=6)。 结论 方法稳定、可靠，可作为该制剂的质量控制方法。

肝康宁颗粒；绿原酸；HPLC法；含量

近年来,肝病的发病率呈明显上升趋势,其发病机制有些尚未明确。现代医学认为可能与多种因素有关,如脂质代谢异常、激素水平改变、环境与遗传因素等原因,引发肝脏病变所致。肝病的病变为可逆性病变在早期诊断和合理治疗下可康复。如不及时治疗,部分肝病患者可能发展为肝纤维化,甚至肝硬化[1]。

肝康宁颗粒系中药制剂，功能为清肝利湿,用于肝胆湿热所致的黄疸，症见周身，小便俱黄，体疲乏力，纳呆，恶心厌油，苔黄腻，脉弦滑数；及急慢性肝炎，迁延性肝炎及慢性胆囊炎等。经国家认定列为全国中医院急诊科（室）必备中成药，该药已被国家列为中药保护品种[2]。

肝康宁颗粒由柴胡、田基黄、茵陈、蒲公英、甘草、金钱草等组成[3]。原标准仅有茵陈药材的薄层鉴别，难以控制药品质量，因此用高效液相色谱法测定了绿原酸的含量，并进行了方法学研究，提高了该品质量的可控性[4]。选择茵陈中主要成分绿原酸，进行了含量测定。该试验采用高效液相色谱法。

1 仪器与试剂

Waters515 泵(美国)，2487 紫外检测器（美国）。工作站：CEMO.甲醇、乙腈均为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。药品为中试品（批号分别为20041201、20041203和20041206）。绿原酸（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，110753-200413）。

1.1 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品12.00 mg,置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液5 mL,置25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（0.048 0 mg/mL）[5]。

1.2 供试品溶液的制备

取装量差异项下的该品，研细，取2 g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL,称定重量，超声处理（功率 250 W,频率 50 kHz）50 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得[6]。

标准溶液的制备：精密称取绿原酸对照品10.05 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL，分别置 25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ODS C18 柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）。 流动相:乙腈-2%醋酸溶液（13：87）。理论板数按绿原酸峰计不得低于2 500[7-8]。

2.2 检测波长的确定

取绿原酸对照品溶液，在200～500 nm光谱扫描，其最大吸收波长在327 nm,因此选用检测波长为327 nm。

2.3 供试液制备方法考察

2.3.1 提取溶剂的选择 分别采用甲醇、50%甲醇和95%甲醇为溶剂，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）50 min。见表1。

表1 提取溶剂的选择

结果表明，以50%甲醇为提取溶剂，绿原酸提取率最高，故选择50%甲醇作为提取溶剂。

2.3.2 提取方式的选择 以50%甲醇为溶剂，分别采用下列提取方式提取50 min。见表2。

表2 提取方式的选择

结果表明:两种提取方式无明显差异，考虑到超声提取易于操作，故选择超声提取作为含量测定的提取方式。

2.3.3 提取时间的选择 以50%甲醇作为提取溶剂，对下列超声提取时间（功率250 W,频率40 kHz）进行了考察。见表3。

表3 提取时间的选择

结果表明，提取50 min与提取70 min无明显差异，其提取率均比提取30 min高，为节约时间，提高效率，选择超声提取50 min。

2.4 绿原酸线性关系考察

照高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录VID）试验，分别精密吸取上述对照品溶液各20 μL依次注入高效液相色谱仪，测定峰面积。见表4。

表4 绿原酸线性关系考察

图1 绿原酸标准曲线

以绿原酸进样量（μg）对绿原酸峰面积值进行线性回归，以进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：Y=1 025 887X-65 235,相关系数r=0.999 8。结果表明：绿原酸进样量在0.32～1.93 μg范围内与峰面积称线性关系。见图1。

2.5 系统适应性及空白试验

称取茵陈阴性样品2 g，同上操作，制成空白对照溶液。按上述仪器和试验条件，精密吸取对照品溶液、供试品溶液及空白对照溶液各20 μL，注入液相色谱仪，分别进行测定。从色谱图可见，供试品溶液色谱中在与对照品溶液色谱中绿原酸峰相应位置处显相同的峰，且与其它峰完全分开；而空白对照溶液色谱中在与对照品溶液色谱绿原酸峰相应位置处均未出现相同的峰。所以，空白对照溶液不干扰样品中绿原酸的测定。

2.6 精密度试验

精密吸取供试品溶液20 μL，重复进样测定，测定6次。结果表明，该法精密度良好。见表5。

表5 精密度试验结果

2.7 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20 μL，每隔一定时间进样测定一次，共测定8 h。结果表明，供试品溶液在8 h内基本稳定。见表6。

表6 稳定性试验结果

2.8 重复性试验

按前文所述“含量测定”方法，对同一批样品（20041201）分别制备6份供试品溶液，各吸取20 μL注入液相色谱仪，测定。结果表明，该法重复性良好。见表7。

2.9 回收率试验

精密称取绿原酸对照品60.00 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为已知量的对照品（1.200 mg/mL）。 称取批号为（20041201）的样品 6 份，每份约0.1 g，按法配成供试品，分别精密加入上述对招聘1 mL,按供试品溶液项下测定，得如下结果。结果表明，回收率在95%～105%之间，加样回收良好。见表8。

表7 重复性试验结果

表8 绿原酸回收率试验结果

2.10 样品的测定及最低限量的确定

按上述测定方法，对10批中试样品进行了绿原酸的含量测定。见表9。

表9 样品的测定结果

参考不同产地茵陈药材中绿原酸的最低含量0.41%，并根据成品中绿原酸转移率为36.29%及上述10批中试样品的测定结果，暂定该品每袋含绿原酸(C16H1809)计不少于6.0 mg。

3 讨论

曾对下述流动相进行了使用摸索，乙腈-2%磷酸溶液（9：91），乙腈-2%醋酸溶液（13：87），结果以乙腈-2%醋酸溶液（13：87）分离效果及峰形最好，因而选择此流动相为绿原酸测定的流动相。

提取方式的选择方面以50%甲醇为溶剂，分别采用回流提取和超声提取50 min，结果表明两种提取方式无明显差异，考虑到超声提取易于操作，故选择超声提取作为含量测定的提取方式。

采用高效液相色谱法测定该品中绿原酸含量，结果显示所采用的方法准确、重现性、回收率和线性相关系良好，操作简便，可作为该品的质量控制标准。

[1]国家药品委员会.中国药典2005年[M].北京：化学工业出版社，2000：177.

[2]卓菊,孙春燕.高效液相色谱法测定茵陈清肝颗粒中绿原酸的含量[J].时珍国医国药，2005，16（6）：509.

[3]黄丽丹,阚家义.降脂冲剂的质量标准研究 [J].中成药，2002，24（3）：184-185.

[4]王隶书，程东岩.HPLC法测定不同产地的三七叶中人参皂苷Rb3的含量[J].中国药师，2004,7(11):857-858.

[5]国家药品监督管理局.中成药地方标准上升国家标准部分·内科·肝胆分册[M].北京：上海科学技术出版社，2002：309.

[6]卫生部药品标准[S].中药成方制剂第十册，1998：36.

[7]陈延清.HPLC法测定消核片中丹参素的含量[J].中草药，2000，31（4）：269-270.

[8]吕武清，龙新华.中成药中的薄层鉴别[M].北京：人民卫生出版社，1997:435，557.

Measurement of Chlorogenic Acid in Gankangning Granula by HPLC

GUO Hong-wei
Department of Pharmacy,Jining No.1 People’s Hospital,Jining,Shandong Province,272011 China

ObjectiveA reasonable,stable and effective method of measuring the content of chlorogenic acid in gankangning granula is to be established.MethodsHigh Performance Liquid Chromatography method was used to measure the content of the chlorogenic acid.Chromatographic column:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm).Mobile phase:acetonitrile-2%Acetic acid solution(13:87).Flowrate:1mL/min,determinationwavelength:327nm.ResultsChlorogenicacidintherangeof0.32～1.93 μg linear correlation performed well.The regression equation was Y=1 025 887X-65 235,and the average recovery was 99.06%(RSD=1.10%,n=6).The correlation coefficient(r=0.999 8).The precision RSD=0.61%(n=6)and reproducibility RSD=0.56%(n=6).ConclusionThis method is stable and reliable and can be used as the quality control method of the preparation.

Gankangning granula;Chlorogenic acid;HPLC method;Content

R286.0

A

1672-5654（2017）08（a）-0036-04

2017-05-09）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.22.036

国宏伟（1981-），男，山东济宁人，本科，主管药师，研究方向：抗菌药物的临床应用。