三阴乳腺癌原发灶和转移灶中ER-α36、EpCAM、Sox2的表达及临床意义

李佳艺 游雪叶 叶煌阳 张映红

(厦门大学附属第一医院厦门市肿瘤医院肿瘤内科，福建 厦门 361000)

三阴乳腺癌原发灶和转移灶中ER-α36、EpCAM、Sox2的表达及临床意义

李佳艺 游雪叶1叶煌阳 张映红

(厦门大学附属第一医院厦门市肿瘤医院肿瘤内科，福建 厦门 361000)

目的探讨雌激素受体(ER)-α36、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、性别决定区Y框蛋白(Sox)2在三阴乳腺癌(TNBC)原发灶和转移灶中的表达及临床意义。方法TNBC患者的石蜡标本62例，其中48例有对应的术后转移灶石蜡标本，采用免疫组织化学法检测ER-α36、EpCAM、Sox2在48例TNBC原发灶和相应转移灶中的表达情况，分析ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表达与TNBC患者临床病理特征的关系，并且分析TNBC组织中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白之间的关系。结果在TNBC原发灶和转移灶中ER-α36、Sox2的高表达率差异有统计学意义(P<0.05)，EpCAM的高表达率差异无统计学意义(P>0.05)。TNBC组织中，ER-α36的高表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，EpCAM的高表达与肿瘤的组织学分期有关(P<0.05)，而Sox2的高表达与淋巴结转移和肿瘤TNM分期有关(P<0.05)，EpCAM与Sox2的表达存在正相关性(r=0.790，P<0.05)。结论ER-α36和Sox2的高表达提示着TNBC的高侵袭性，且EpCAM与Sox2在TNBC的侵袭转移中发挥着协同作用，ER-α36、EpCAM、Sox2均可作为TNBC侵袭转移的潜在分子治疗靶标。

三阴乳腺癌；雌激素受体-α36；上皮细胞黏附分子；性别决定性Y框蛋白；转移

三阴乳腺癌(TNBC)是指雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人表皮生长因子受体(HER)2均表达阴性的乳腺癌，其恶性程度高，易转移，患者预后差。因其ER表达阴性，TNBC患者并不能受益于内分泌治疗，而针对HER2的靶向治疗在TNBC患者的治疗中也无法发挥作用〔1〕。ER-α36发挥着与ER-α截然不同的生理效应，在TNBC的发生发展、侵袭转移、内分泌及化疗耐药中发挥着重要功能〔2〕。上皮细胞黏附分子(Sox)2是一种与性别决定区Y(SRY)蛋白相关的转录因子，两者在多种恶性肿瘤细胞中过表达，与肿瘤的侵袭转移密切相关〔3〕。EpCAM及Sox2属于肿瘤干细胞标志物，在正常乳腺上皮细胞内并不表达，在不同乳腺癌细胞中的表达也各有差异。以上三者在乳腺癌的侵袭转移过程发挥着重要功能，但目前关于ER-α36、EpCAM以及Sox2在TNBC原发灶和转移灶中表达差异的研究尚少，本研究旨在探讨ER-α36、EpCAM、Sox2 在TNBC患者原发灶和转移灶中的表达情况。

1 材料与方法

1.1对象 收集1996年3月至2015年9月入住厦门大学附属第一医院的TNBC患者的石蜡标本62例，均经病理组织学确诊，其中48例有对应的术后转移灶石蜡标本。患者均有完整的病历资料，知情同意，并经医院伦理委员会审核同意。

1.2试剂与方法 兔抗人ER-α36抗体(CY1109，北京四正柏生物科技有限公司)，鼠抗人EpCAM单克隆抗体(AUA1，ab20160，美国Abcam公司)；鼠抗人Sox2单克隆抗体(E4，sc365823，Santa Cruz公司)；SP试剂盒(上海酶联生物公司)；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。试验标本均用4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片。石蜡切片，常规脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，微波修复抗原，滴加正常山羊血清室温封闭20 min，弃去血清，分别滴加ER-α36、EpCAM、Sox2一抗工作液，37℃孵育2 h，PBS洗涤后，滴加生物素二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤后，DAB显色，冲洗，苏木素复染，封片。以PBS替代一抗作阴性对照。

1.3结果判定 ER-α36染色定位在细胞膜和细胞质，EpCAM染色定位在细胞膜，Sox2染色定位在细胞核。采用Mathew〔4〕积分法进行结果判断。每例标本均选择10个含有阳性细胞的高倍视野(×400)分别计数100个细胞，取其平均值计算阳性细胞百分率。按阳性细胞百分率判定：无阳性细胞为0分；≤25%为1分；26%～50%为2分；>50%为3分。按染色程度判定：无阳性着色为0分；浅黄色为1分；深黄色为2分；棕黄色为3分。染色指数为阳性细胞百分率与染色强度之和：最小值0分，最大值6分。在统计分析中，将>3分判定为高表达；≤3分定为低表达或阴性。

1.4统计学方法 应用SPSS20.0软件进行χ2检验、Spearman等级相关性分析。

2 结 果

2.1ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白在TNBC原发灶和转移灶的表达 ER-α36定位于细胞膜和细胞质，EpCAM定位于细胞膜，Sox2定位于细胞核，均呈现棕黄色颗粒。ER-α36在原发灶和转移灶中的高表达率分别为56.25%和77.08%，差异具有统计学意义(χ2=4.688，P=0.030)；EpCAM分别为72.92%和75.00%，差异无统计学意义(χ2=3.740，P=0.053)；Sox2分别为52.08%和79.17%，差异具有统计学意义(χ2=7.804，P=0.005)。在48例患者中，有16例ER-α36在原发灶中低表达，而在转移灶中为高表达；有12例EpCAM在原发灶中低表达，而在转移灶中为高表达；有18例Sox2在原发灶中低表达，而在转移灶中为高表达。见图1。

2.2ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表达与TNBC临床病理特征的关系 TNBC患者的ER-α36蛋白表达与淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者的年龄、绝经状态、肿瘤大小、组织学分期、TNM分期无关(P>0.05)；TNBC患者的EpCAM蛋白表达与组织学分期有关(P<0.05)，与患者的年龄、绝经状态、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期无关(P>0.05)；TNBC患者的Sox2蛋白表达与淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05)，与患者的年龄、绝经状态、肿瘤大小、组织学分期无关(P>0.05)。见表1。

图1 TNBC组织中ER-α36、EpCAM、Sox2的免疫组化染色结果(×400)

表1 ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白表达与TNBC临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.3TNBC组织中ER-α36、EpCAM、Sox2蛋白的关系 在TNBC组织中，ER-α36与EpCAM、Sox2的表达均不具有相关性(r=0.352，0.455；P=0.324，0.273)。但EpCAM与Sox2的表达在TNBC组织中存在正相关性(r=0.790，P=0.000)，两者在TNBC的侵袭转移中发挥着协同作用。Sox2低表达，EpCAM低表达11例，高表达12例；Sox2高表达，EpCAM低表达2例，高表达23例。

3 讨 论

TNBC占乳腺癌患者的30%左右，这部分患者并不能受益于内分泌治疗(如三苯氧胺，他莫昔芬等)和HER2靶向治疗(如曲妥珠单抗等)，且易发生转移，是TNBC患者预后差的主要原因〔5〕。

ER属于配体依赖的核受体，能够介导大部分的雌激素信号转导，目前发现的人类ER主要分为两个亚型：ER-α与ER-β，其中ER-α主要表达于乳腺和子宫组织中，针对ER-α设计的内分泌治疗药物，在乳腺癌患者的临床治疗中起到了非常好的治疗效果，ER-α的表达水平是预测乳腺癌患者对内分泌治疗疗效和预后的关键指标。ER-α36是ER-α的一个分子量为36 kD的亚型，研究发现，ER-α36在乳腺癌的肿瘤形成、侵袭转移以及内分泌耐药中均发挥着重要的功能〔6〕。研究发现〔7〕，在MCF-7乳腺癌细胞内过表达ER-α36能够促进细胞的侵袭转移能力，同时，在MDA-MB-231乳腺癌细胞内敲除ER-α36的表达能够抑制细胞的侵袭转移能力〔8〕。本研究结果说明ER-α36的高表达促进了TNBC的转移。

EpCAM是一种肿瘤相关抗原，在多种上皮肿瘤中过量表达，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌、卵巢癌等，在德国EpCAM单克隆抗体(17-1A，edrecolomab)已被批准许可用于直肠癌的术后辅助化疗〔9〕，目前已研制出含有edrecolomab的癌症疫苗IGN-101〔10〕。EpCAM除了具有黏附分子的功能外，还参与了细胞增殖分化、迁移和免疫逃逸等多种生理活动。Soysal等〔11〕检测了1 365例乳腺癌样本中EpCAM的表达水平，其过表达率为48%，其中TNBC样本中的过表达率为63.8%。本研究中，EpCAM的高表达率与组织分型有关，且TNBC患者的原发灶和转移灶中EpCAM的高表达率分别为72.92%和75.00%，两者之间的差异无统计学意义，但其表达水平远远超过了正常乳腺癌组织，仍然能够受益于EpCAM单克隆抗体17-1A〔9〕。

转录因子Sox2属于Sox基因家族，是维持干细胞特性的关键因子，与多种肿瘤的形成密切相关。在卵巢癌〔12〕、侵袭性神经胶质瘤〔13〕中，Sox2促进了肿瘤的发生，属于原癌基因，但在胃癌中，Sox2的表达下调，又扮演了抑癌基因的角色〔14〕。Sox2并不在人正常乳腺组织中表达，在各种乳腺癌亚型中的表达也存在差异，Zheng等〔15〕的Meta分析结果显示，Sox2在乳腺癌的表达率为38.18%。本研究中，Sox2的高表达与淋巴结转移、肿瘤TNM分期关系密切，Sox2在TNBC原发灶和转移灶中的高表达率分别为52.08%和79.17%，说明Sox2的高表达促进了TNBC的远处转移，可以作为预测TNBC侵袭转移和不良预后的参考指标。

此外，本研究中发现EpCAM与Sox2在TNBC组织中的表达存在相关性。Lin等〔16〕发现中EpCAM可以上调Sox2的表达，从而促进肿瘤的形成。Abd-El-Magsoud等〔17〕检测145例乳腺癌组织中EpCAM与Sox2的表达水平，证实EpCAM与Sox2之间存在着正相关性，与本研究的结果相符，EpCAM与Sox2可能在TNBC的侵袭转移中发挥着协同作用。

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2李广亮，滕理送.雌激素受体亚型ER-α36与乳腺癌关系的研究进展〔J〕.肿瘤防治研究，2016；43(3)：238-42.

3Raimondi C，Nicolazzo C，Gradilone A.Circulating tumor cells isolation：the post-EpCAM era〔J〕.Chin J Cancer Res，2015；27(5)：461-70.

4Mathew J，Pathrose S，Kottoor J，etal.Evaluation of an indigenously prepared herbal extract(EndoPam)as an antimicrobial endodontic irrigant：an ex vivo study〔J〕.J Int Oral Health，2015；7(6)：88-91.

5韩颜泽，赵金鹏，孙岩岩，等.三阴型乳腺癌的化学治疗和靶向治疗进展〔J〕.现代生物医学进展，2014；14(22)：4397-400.

6Pan X，Zhao B，Song Z，etal.Estrogen receptor-α36 is involved in epigallocatechin-3-gallate induced growth inhibition of ER-negative breast cancer stem/progenitor cells〔J〕.J Pharmacol Sci，2016；130(2)：85-93.

7刘旺根，张钦宪，王云龙，等.ER-α36过表达促进人乳腺癌MCF-7细胞侵袭转移能力〔J〕.基础医学与临床，2013；33(6)：713-7.

8Zhang J，Li G，Li Z，etal.Estrogen-independent effects of ER-α36 in ER-negative breast cancer〔J〕.Steroids，2012；77(6)：666-73.

9Dhayat S，Sorescu S，Vallböhmer D，etal.Prognostic significance of EpCAM-positive disseminated tumor cells in rectal cancer patients with stage I disease〔J〕.Am J Surg Pathol，2012；36(12)：1809-16.

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11Soysal SD，Muenst S，Barbie T，etal.EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+)，basal-like，and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer〔J〕.Br J Cancer，2013；108(7)：1480-7.

12Lou X，Han X，Jin C，etal.SOX2 targets fibronectin 1 to promote cell migration and invasion in ovarian cancer：new molecular leads for therapeutic intervention〔J〕.OMICS，2013；17(10)：510-8.

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14Wang S，Tie J，Wang R，etal.SOX2，a predictor of survival in gastric cancer，inhibits cell proliferation and metastasis by regulating PTEN〔J〕.Cancer Lett，2015；358(2)：210-9.

15Zheng Y，Qin B，Li F，etal.Clinicopathological significance of Sox2 expression in patients with breast cancer：a meta-analysis〔J〕.Int J Clin Exp Med，2015；8(12)：22382-92.

16Lin CW，Liao MY，Lin WW，etal.Epithelial cell adhesion molecule regulates tumor initiation and tumorigenesis via activating reprogramming factors and epithelial-mesenchymal transition gene expression in colon cancer〔J〕.J Biol Chem，2012；287(47)：39449-59.

17Abd-El-Magsoud M,El-Rehin DM.Clinicopathologic implications of EpCAM and Sox2 expression in breast cancer〔J〕.Clin Breast Cancer，2014；14(1)：e1-9.

〔2017-04-18修回〕

(编辑 袁左鸣)

福建省卫生厅青年科研课题(No.2012-2-77)

张映红(1958-)，女，主任医师，主要从事恶性肿瘤规范化诊疗研究。

李佳艺(1977-)，女，副主任医师，主要从事恶性肿瘤规范化诊治、乳腺癌复发、耐药机制研究。

R73

A

1005-9202(2017)17-4190-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.009

1 厦门大学附属第一医院病理科