硫化氢在外源性SB203580预处理人卵巢癌SKOV3细胞增殖中的作用

吕锡芳 陈志刚 何雄伟

(石河子大学医学院第一附属医院妇产科,新疆 石河子 832008)

硫化氢在外源性SB203580预处理人卵巢癌SKOV3细胞增殖中的作用

吕锡芳 陈志刚 何雄伟

(石河子大学医学院第一附属医院妇产科,新疆 石河子 832008)

目的探讨硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(NaHS)对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及可能机制。方法体外培养SKOV3细胞，随机分为正常对照组、NaHS组、SB203580组、NaHS+SB203580组，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组SKOV3细胞增殖，流式细胞术检测各组SKOV3细胞周期分布，Western印迹检测各组SKOV3细胞中P-p38MAPK蛋白表达。结果与正常对照组比较，NaHS组SKOV3细胞增殖明显增加，G1期细胞明显减少，S期细胞明显增加，且p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.01)；SB203580组、NaHS+SB203580组SKOV3细胞增殖均明显减少，G1期细胞均明显增加，S期细胞均明显减少，且p-p38MAPK表达均明显降低(均P<0.01)。而与NaHS组比较，SB203580组、NaHS+SB203580组SKOV3细胞增殖均明显减少，G1期细胞均明显增加，S期细胞均明显减少，且p-p38MAPK表达均明显降低(均P<0.01)；与SB203580组比较，NaHS+SB203580组SKOV3细胞的增殖明显增加，G1期细胞明显减少，S期细胞明显增加，且p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.01)。结论H2S可能通过活化p38MAPK信号通路促进SKOV3细胞增殖。

卵巢癌细胞；硫化氢；p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路；细胞增殖

卵巢癌是女性恶性肿瘤中导致死亡的主要原因之一，寻找能够抑制卵巢癌细胞增殖的药物或因子具有重要意义。硫化氢(H2S)广泛分布于心血管、内脏和神经系统等组织〔1〕。研究显示，内源性或外源性H2S能促进肿瘤细胞增殖，抑制其凋亡〔2～4〕，但具体机制尚不清楚。研究发现，p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的激活可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，而H2S可通过p38MAPK信号通路调节细胞增殖与凋亡〔5〕。本课题组观察了H2S对SKOV3细胞增殖的影响，并探讨p38MAPK 信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 SKOV3细胞株(中科院上海细胞库)磷酸盐缓冲液(PBS，上海生工)，二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、硫氢化钠(NaHS，Sigma公司)，SB203580(德国Merck公司)，无血清细胞冻存培养基(RPMI)1640培养基(Invitrogen公司)，无支原体胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，RNA酶(上海生工)，兔抗人磷酸化(p)-p38单克隆一抗(Cell Signal Technology公司)，二抗检测试剂盒(北京中杉金桥有限公司)，化学发光试剂盒(Thermo 公司)，变性型裂解液(北京索来宝公司)。

1.2细胞培养 经细胞复苏后的SKOV3细胞，用含10%FBS的RPMI1640培养基在恒温培养箱中培养，当细胞生长达培养瓶80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化细胞后传代培养。

1.3实验分组 正常对照组(加入含10% FBS的RPMI1640培养液)，NaHS组(正常对照组基础上加入NaHS，使其终浓度为50 μmol/L)，SB203580组(正常对照组基础上加入SB203580，使终浓度为75 μmol/L)，NaHS+SB203580组(NaHS组基础上加入SB203580，使其终浓度为75 μmol/L)，在恒温培养箱中干预培养48 h。SB203580 组、SB203580+NaHS组分别在 NaHS 作用4 h后加药。

1.4MTT法检测SKOV3细胞增殖 SKOV3细胞以5×104个/ml，接种于96孔板内，200 μl/孔，待细胞完全贴壁后，加入RPMI1640同步化24 h，然后按照实验分组干预培养48 h，每个实验组设3个复孔，各组结束干预前4 h，每孔分别加入20 μl MTT溶液(浓度为5 mg/ml)，继续避光培养4 h，弃上清，加入DMSO溶液150 ml/孔，室温避光振荡10 min，使结晶溶解，酶标仪测定各孔吸光度值(A450)。每次实验均设无细胞对照作为空白调零组，重复3次，并计算细胞抑制率：抑制率(IR)=(A对照组值-A实验组值)/(A对照组值)×100%。

1.5流式细胞术检测SKOV3细胞周期分布 SKOV3细胞以5×105个/ml接种于6孔板内，2 ml/孔，待细胞完全贴壁后，用RPMI1640同步化24 h后，按照实验分组干预培养48 h，每个实验组设3个复孔，48 h后消化收集细胞，用预先冻存的70%冰乙醇重悬细胞，吹打混匀，4℃固定过夜，过夜后离心去除乙醇，PBS 洗涤3遍，再用500 μl PBS重悬细胞，加入RNA酶，使其终浓度为250 μg/ml，于37℃孵育30 min，然后加入5 μl碘化丙啶染液，37℃避光保存30 min，上机检测。实验重复3次，并按以下公式计算系膜细胞增殖指数(PI)=S期和G2/M期细胞比例之和/G1期、S期和G2/M期细胞比例之和。

1.6Western印迹检测SKOV3细胞中p-p38蛋白表达 SKOV3细胞以5×106个/ml接种于6孔培养板中，2 ml/孔，待细胞完全贴壁后，用RPMI1640同步化24 h后，按照实验分组干预培养48 h后，加入细胞裂解液，冰上静置20 min，12 000 r/min 离心20 min，取上清后测定蛋白浓度，统一蛋白浓度为20 g/L，经100℃水浴变性后待用。每孔每次加样10 μl，在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶中电泳分离，位置标记，半干转法将蛋白从凝胶中转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温5%牛血清蛋白(BSA)封闭2 h，加一抗(1∶1 000)，4℃冰箱过夜，洗膜缓冲液(TBST)洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶30 000)，室温下孵育2 h，TBST洗膜后加入化学发光试剂曝光，显影、定影后将胶片置于凝胶成像分析进行定量分析。用同样方法检测 β-肌动蛋白(actin)的表达。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组SKOV3细胞增殖 与正常对照组比较，NaHS组明显促进SKOV3细胞增殖，而SB203580组、NaHS+SB203580组均能明显抑制SKOV3细胞增殖；与NaHS组比较，SB203580组、NaHS+SB203580组均能明显抑制SKOV3细胞的增殖；而与SB203580组比较，NaHS+SB203580组能明显促进SKOV3细胞的增殖(均P<0.01)。见表1。

2.2各组干预48 h后SKOV3细胞周期分布 与正常对照组相比，NaHS组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞均明显增加，而SB203580组、NaHS+SB203580组G0/G1期细胞均明显增加，S期细胞均明显减少；与NaHS组比较，SB203580组、NaHS+SB203580组G0/G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少；与SB203580组比较，NaHS+SB203580组G0/G1期细胞明显减少，S期细胞明显增加(均P<0.01)。见表2、图1。

2.3各组干预48 h后SKOV3细胞中p-p38MAPK的表达 与正常对照组比较，NaHS组中p-p38MAPK蛋白的表达显著增加，而SB203580组、NaHS+SB203580组显著降低；与NaHS组比较，SB203580组、NaHS+SB203580组显著降低；而与SB203580组比较，NaHS+SB203580组显著增加(均P<0.01)。见表2、图2。

表1 各组SKOV3细胞增殖情况

与正常对照组相比:1)P<0.01；与NaHS组相比:2)P<0.01；与SB203580组比较:3)P<0.01；下表同

表2 各组干预48 h后SKOV3细胞周期分布及p-p38 MAPK的表达

图1 各组干预48 h后SKOV3细胞周期分布

1.正常对照组，2.NaHS组，3.SB203580组，4.NaHS+SB203580组图2 p-p38MAPK蛋白的表达(Western印迹法)

3 讨 论

虽然目前手术及放化疗等传统治疗手段不断改进，但卵巢癌总5年生存率仍<30%。Yan等〔6〕研究发现，低剂量NaHS(30～50 μmol/L)可促进细胞增殖，提高细胞生存率，而高浓度NaHS(1 mmol/L)则抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。Abrahamsen等〔7〕研究表明H2S可以启动凋亡机制诱导细胞死亡，促进细胞增殖。p38MAPK信号通路活化可以抑制多种细胞凋亡、促进细胞周期及细胞增殖，在细胞增殖与凋亡中起重要作用。Keuling等〔8〕用SB203580特异性阻断p38MAPK通路能抑制黑色素瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。本文结果说明SKOV3细胞中存在p38MAPK信号通路，且p38MAPK信号通路可能参与了SKOV3细胞增殖的调控，当此通路被抑制后，SKOV3细胞的增殖亦被显著抑制。本研究说明NaHS能明显促进SKOV3细胞的增殖，而当运用p38MAPK信号通路活抑制剂阻断该通路，NaHS对SKOV3细胞的增殖作用也会减弱，甚至消失，p38MAPK蛋白表达亦明显降低，这进一步说明SKOV3细胞中存p38MAPK信号通路，NaHS可能通过活化 p38MAPK信号通路而促进SKOV3细胞的增殖。

1Martelli A，Testai L，Marino A，etal.Hydrogen sulphide：biopharmacological roles in the cardiovascular system and pharmaceutical perspectives〔J〕.Curr Med Chem，2012；19(20)：3325-36.

2Chattopadhyay M，Kodela R，Olson KR，etal.NOSH-aspirin (NBS-1120)，a novel nitric oxide-and hydrogen sulfide-releasing hybrid is a potent inhibitor of colon cancer cell growth in vitro and in a xenograft mouse model〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2012；419(3)：523-8.

3Chattopadhyay M，Kodela R，Nath N，etal.Hydrogen sulfide-releasing NSAIDs inhibit the growth of human cancer cells：a general property and evidence of a tissue type-independent effect〔J〕.Biochem Pharmacol，2012；83(6)：715-22.

4周建斌，盛顺良，周寿红，等.外源性硫化氢通过 PI3K/Akt 信号通路诱导人卵巢癌细胞凋亡〔J〕.中国妇幼保健杂志，2013；28(30)：5029-32.

5徐 霞，李 睿，任 蔷，等.硫化氢在SB203580影响肝星状细胞增殖、凋亡中的作用〔J〕.天津医药，2013；41(11)：1095-8.

6Yan SK，Chang T，Wang H.Effects of hydrogen sulfide on homocysteine-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006；351(2)：485-91.

7Abrahamsen H，Stenmark H，Platta HW.Ubiquitination and phosphorylation of Beclin 1 and its binding partners：tuning class Ⅲ phosphatidylinositol 3-kinase activity and tumor suppression〔J〕.FEBS Lett，2012；586(11)：1584-91.

8Keuling AM，Andrew SE，Tron VA.Inhibition of p38 MAPK enhances ABT-737-induced cell death in melanoma cell lines：novel regulation of PUMA〔J〕.Pigment Cell Melanoma Res，2010；23(3)：430-40.

〔2016-07-08修回〕

(编辑 苑云杰/王一涵)

国家重大攻关专项(No.2013GS650104)

何雄伟(1980-)，男，主治医师，主要从事心理疾病研究。

吕锡芳(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇科肿瘤研究。

R737.3

A

1005-9202(2017)17-4188-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.008