导入OsVTE 基因提高普那菊苣的抗旱性

穆志新， 师 颖， 张丽君， 周建萍

(山西省农业科学院农作物品种资源研究所 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室, 山西 太原 030031)

生育酚是一类重要的脂溶性抗氧化剂，在高等植物及蓝细菌光合器官中合成[1]，是动物和人类维持生长、繁殖和保证健康所需要的一种重要的营养物质，具有重要的代谢功能和抗氧化作用，统称为维生素E(VE)[2-3]。植物在生长过程中会遭遇干旱、高盐、高温等逆境胁迫，这些胁迫会使其体内蛋白质、叶绿素、脂类等许多重要成分发生氧化，并导致细胞死亡。生育酚作为一种抗氧化剂，可以清除单线态氧[4]，使活性氧自由基失活，并通过与膜脂水解产物形成复合物，清除类囊体膜上的脂质过氧化产物，阻止膜脂过氧化的扩大，从而保护膜的完整性。提高植物生育酚含量可以增加植物对干旱、高盐、高温等逆境的抵抗性[5]．已有研究表明，油菜(BrassicacampestrisL.)中过量表达生育酚环化酶基因OsVTE可以增加油菜籽中生育酚总量，并改变菜籽油中生育酚的组成[6]。烟草(NicotianatabacumL.)植株中过量表达OsVTE可以提高植株的耐盐性[7]。

菊苣(CichoriumintybusL)为菊科(Asteraceae)菊苣属(Cichorium)多年生宿根草本双子叶植物。菊苣具有药用和食用价值，其干物质中粗蛋白含量约占30%，粗脂肪约占5.3%，粗纤维约为9.9%，无氮浸出物约为30%，并富含17种氨基酸，钙(12.3%)、磷(0.53%)、钾、钠、锌、铜等微量元素含量也较高，还含有多种维生素，更重要的是含有一些生物化学成分：马栗树皮素、马栗树皮甙、野莴苣甙、山莴苣素和山莴苣苦素等特殊成分，有抗菌、提高食欲，改善消化功能，是其他牧草植物所不具有的[8-9]。在我国主要分布在西北、华中、华北、东北地区，这些地区都比较干旱、寒冷，不利于普那菊苣的生长，因此通过基因工程手段提高普那菊苣的耐盐能力具有明显的应用价值，在美国该作物已被批准为商业化种植的转基因作物[10-11]。目前已报道AtNHX1[12]、AtNHX2[13]以及APX[14]基因可以提高普那菊苣的耐盐性和抗逆性。通过培育适合于我国西北部地区栽培的抗干旱、耐盐碱的牧草新品种，解决牧草品种较少，品种更新慢的问题，进一步改善生态环境。本研究应用农杆菌介导法将OsVTE基因转入普那菊苣中，获得了转基因植株，并对该基因对普那菊苣抗逆性的影响进行了研究，以便为提高普那菊苣的抗逆性，进而为其在生态环境较恶劣地区的推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及供体质粒

供试植物材料为普那菊苣2 n=2 x=18，种子由山西省农业科学院畜牧兽医研究所提供。来自水稻的OsVTE基因载体由中国科学院遗传发育研究所803组陈受宜研究员提供，质粒名称为pBin438- VTE；启动子：CaMV35S，终止子：Nos。农杆菌菌株是GV3101，其菌落筛选标记基因为卡那霉素(Km)和利福平( rif )抗性基因，植物筛选标记基因为Km 抗性基因。

1.2 农杆菌介导法转化普那菊苣及转化再生植株的获得

将普那菊苣的无菌苗叶片在MS 固体培养基上预培养2～3 d。用培养至对数生长期(OD600约为0.4～0.6)的上述农杆菌菌株侵染普那菊苣叶片8 min，并在生长素(IAA) 2.0 μM + 激动素(KT)5.0 μM + 水解酪蛋白 (CH) 100 mg·L-1的MS固体培养基上共培养2～3 d，然后转入含 IAA 2.0 μM + KT 5.0 μM + CH 100 mg·L-1及60 mg·L-1Km 和1 000 mg·L-1头孢霉素(cef)的MS 固体筛选培养基上培养，待不定芽长至1 cm时，转移到含80 mg·L-1Km 和1 000 mg·L-1cef的MS + 2.0 mg·L-1IBA固体培养基上生根。

1.3 卡那霉素抗性植株的PCR分析和Southern杂交分析

对Km抗性植株总DNA进行PCR扩增，检测目的基因OsVTE是否存在。PCR扩增时以未转化普那菊苣植株为阴性对照，以质粒DNA为阳性对照。将扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳，通过观察特异性条带的有无来初步确定目的基因是否已经转入。PCR扩增的引物分别为：引物1：5’-CGCACAGCGGGTATCACTAT-3’；引物2：5’-AGCAAGCCAACCAGCAGTT-3’(由上海生工生物工程公司合成)。扩增片段大小为700 bp。PCR反应体系为20 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s；53℃退火45 s；72℃延伸50 s；进行35次循环；然后72℃终延伸10 min。

为进一步证实PCR扩增结果的可靠性，提取未转化植株和扩增结果为阳性的植株中随机选取几个扩增条带亮度不同的阳性植株叶片总DNA进行Southern 杂交，以含有外源基因的质粒DNA为阳性对照。以限制性内切酶Hind Ⅲ 酶切20 μg 总DNA，37℃温浴过夜。以地高辛(Digoxigenin (DIG) -dUTP)标记的OsVTE基因为探针，杂交温度为68℃，过夜。以CSPD (4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2’- (5’- chloro) tricyclo [3.3.1.1] decan) -4-yl } phenyl phosphate (CSPD) 为发光底物。具体操作根据Southern 试剂盒(The Dig DNA Labeling and Detection试剂盒)操作手册进行，CSPD 购于Boehringer Mannheim Co. Ltd, Germany。Southern 杂交中以地高辛标记的OsVTE扩增产物为探针。探针制备方法如下，

扩增体系：buffer: 2 μL； dNTP (地高辛标记)：4 μL； p1：0.8 μL；p2: 0.8 μL； Taq (2 μ·μL-1)：1 μL； ddH2O：10.4 μL；template(质粒DNA)：1 μL 。

扩增程序：94℃ 5 min； 94℃ 30 s； 56℃ 50 s； 72℃ 50 s； 72℃ 10 min；循环35次。

1.4 普那菊苣干旱胁迫处理方法

选取未转化植株和Southern杂交分析检测含单拷贝外源基因转基因植株，做以下处理：

在普那菊苣培养基中分别添加不同浓度的蔗糖、琼脂、甘露醇，造成不同干旱胁迫的培养基上培养30 d，后在含2.0 mg·L-1IBA 的MS 固体生根培养基上恢复生长30 d (25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗)。蔗糖浓度设为：20(CK)，30，40，50，60 g·L-1；琼脂浓度设为：6(CK)，8，10，12，14 g·L-1；甘露醇浓度设为：0(CK)，10，20，30，40 g·L-1。每组处理3个，设3组重复，观察植株的生长情况。

选取5个在试验室抗性试验中表现较好的T0代转基因株系的植株幼苗扩繁，将在MS培养基中生长20 d的幼苗移栽在直径10 cm、高10 cm 的塑料营养钵中，以蛭石作基质，培养30 d 左右，然后移栽至花盆中，14 d后进行旱胁迫处理。试验设3个处理，甘露醇浓度为20，30，40 g·L-1。每组处理20 株，设3组重复，光照培养30 d，观察植株的生长情况。

1.5 生理指标的测定

分别对蔗糖浓度为50 g·L-1、琼脂浓度为10 g·L-1和甘露醇浓度为30 g·L-1胁迫条件件下生长30 d，以及在含2.0 mg·L-1IBA的MS固体生根培养基上恢复生长30 d后的转基因植株的SOD活性、POD活性以及MDA含量进行测定[15]。

1.6 数据分析

试验数据采用Excel 2003及用 DPS 7.05 软件进行方差分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 转OsVTE 基因植株的获得与鉴定

普那菊苣外植体在经过农杆菌感染转化后，在筛选培养基上分化培养30 d左右，外植体分化出现明显差异，经60 mg·L-1Km 筛选后，部分外植体无法形成再生芽，或产生的再生芽在培养中白化死亡。将筛选后长至0.5～1.0 cm的绿色抗性再生芽转移到MS + 2.0 mg·L-1IBA+ 80 mg·L-1Km + 1000 mg·L-1cef 的固体生根培养基上继续进行筛选培养，部分再生芽无法形成根状物。将得到的转化植株在 MS + 2.0 mg·L-1IBA固体生根培养基上继续培养30 d后，进行PCR 检测。普那菊苣共处理外植体640 块，509 块形成愈伤组织，得到109 株再生植株。

图1 普那菊苣转化植株再生Fig.1 Regeneration of transgenic plants of Puna Chicory

用目的基因OsVTE的特异引物对转化处理后再生的普那菊苣进行PCR 检测，从109 株转化植株中，有35 株中扩增出预期大小(700 bp)的片段，而未转化植株中没有扩增出该片段，初步证明OsVTE基因已成功地转入普那菊苣植株。

从PCR 检测呈阳性的材料中随机选取几株扩增片段亮度不同的材料，提取DNA，以HindⅢ限制性内切酶消化后，以OsVTE基因为探针进行Southern blot 杂交分析，杂交结果如图2所示。杂交分析结果表明有3株为单拷贝插入，其余2株为多拷贝插入，未转化植株则无杂交信号。

图2 部分转化植株检测结果Fig.2 Tests for some transgenic plants

2.2 蔗糖浓度对普那菊苣组培苗生理指标的影响

对普那菊苣组培苗培养基添加蔗糖改变渗透压胁迫培养30 d 后，再转移到正常蔗糖浓度培养基上恢复生长30 d，从组培苗的株高变化上看，低浓度(CK)蔗糖对转基因植株幼苗和未转化植株幼苗的生长没有显著的抑制作用。随着蔗糖浓度的升高，抑制作用逐渐加强。蔗糖浓度达到50 g·L-1时未转化植株幼苗生长受到明显抑制，株高较小，植株生长缓慢；转基因植株幼苗仍然保持良好的生长态势。50 g·L-1蔗糖是未转化植株幼苗生长可以承受的最大浓度。在蔗糖浓度为50 g·L-1下(称为延缓生长)，对未转化植株幼苗和转基因植株幼苗的SOD，POD活性以及MDA含量进行测定。转基因植株幼苗与未转化植株幼苗相比SOD、POD活性增强、MDA含量下降。停止胁迫后组培苗恢复生长30 d后(称为恢复生长)的SOD活性、POD活性以及MDA含量各处理间差异均不显著。

表1 蔗糖浓度对普那菊苣组培苗SOD、POD 活性和 MDA 含量的影响Table 1 Effects of sucrose content on the SOD,POD activities and MDA content in leaves of chicory plants

2.4 琼脂浓度对普那菊苣组培苗生理指标的影响

对普那菊苣组培苗培养基添加琼脂改变渗透压胁迫培养30 d 后，再转移到正常琼脂浓度培养基上恢复生长30 d。琼脂浓度低于10 g·L-1时，未转化植株幼苗不如转基因植株幼苗生长旺盛，但尚未明显表现出受抑制；琼脂浓度高于10 g·L-1时，未转化植株幼苗的生长受到明显得抑制，生长缓慢，植株矮小、根系生长弱。琼脂浓度为10 g·L-1时(称为延缓生长)，对其生理指标进行测试，普那菊苣转基因植株幼苗SOD 、POD 活性显著增加，MDA 含量下降。停止胁迫后,组培苗恢复生长30 d后(称为恢复生长)的SOD活性、POD活性以及MDA含量各处理间差异均不显著(表2)。

表2 琼脂浓度对普那菊苣幼苗SOD、POD 活性和MDA 含量的影响Table 2 Effects of agarose concentrations on the SOD 、POD activities and MDA content in leaves of chicory plants

2.5 甘露醇浓度对普那菊苣苗生理指标的影响

对普那菊苣组培苗培养基添加甘露醇改变渗透压胁迫培养30 d 后，再转移到正常培养基上恢复生长30 d。当甘露醇浓度为20 g· L-1时，未转化植株幼苗生长缓慢，出现玻璃化现象，叶片呈淡绿色、萎蔫状，可以生根生长，但生根缓慢，并在基部开始形成少量的保护性的致密细胞团。甘露醇浓度为30 g·L-1时，未转化植株幼苗叶片卷曲变形，严重失绿，幼叶完全不能够正常伸展，根部基本褐化坏死；而转基因植株幼苗在甘露醇的胁迫下叶片变得窄而细，但是仍然能够正常生长，叶片也依然呈现绿色，能够正常生根。甘露醇浓度高于30 g·L-1时，转基因幼苗叶子卷曲、变形，叶片颜色逐渐变为黄绿色，根系不能正常生长。在对不同株系的转基因普那菊苣株系幼苗的观察中发现，不同株系之间对甘露醇的耐受力存在着一些微小的差异，可能与外源基因的拷贝数、插入点和表达量有一定的关系。综上所述，30 g·L-1的甘露醇是未转化植株幼苗可以承受的最大浓度，40 g·L-1的甘露醇是转基因植株幼苗可以承受的最大浓度。甘露醇浓度为30 g·L-1时(称为延缓生长)，对其生理指标进行测试，普那菊苣转基因植株幼苗SOD、POD活性显著增加，MDA含量下降。停止胁迫后组培苗恢复生长30 d (称为恢复生长)后的SOD 活性、POD 活性以及MDA 含量各处理间差异均不显著(表3)。

将含有OsVTE基因的普那菊苣T0代转基因株系进行盆栽，14 d后进行甘露醇胁迫处理，甘露醇浓度为20，30，40 g·L-1，每组处理20 株，3 组重复。胁迫30 d，甘露醇浓度为30 g·L-1时，未转化植株幼苗叶片枯黄死亡，而转基因植株幼苗叶片呈萎蔫状、黄色，胁迫解除后可正常生长。

表3 甘露醇浓度对普那菊苣组培苗SOD、POD和MDA含量的影响Table 3 Effects of mannitol stress on the SOD, POD activities and MDA content in leaves of chicory plants

图3 普那菊苣在甘露醇胁迫下的转基因与非转基因外植体的表现Fig.3 Performance of Puna chicory explants and seedlings under the mannitol stress: transgenic vs non-transgenic.

3 讨论与结论

普那菊苣转化试验中共处理外植体640 块，509 块形成愈伤组织，得到109 株再生植株，其中35 株中扩增出预期大小(700 bp)的片段，初步证明OsVTE基因已成功地转入普那菊苣植株。

在培养基中添加适当浓度的蔗糖能够增强组培苗干物质含量，促进多糖物质的合成和贮藏，增强组培苗的抗逆能力，有利于组培苗的生长，但蔗糖浓度过低或过高则会增加培养基的渗透压，使多糖物质的合成和贮藏受阻，影响营养物质的吸收及植株的正常生长[16]。在培养基中添加甘露醇降低了细胞膨压和渗透势，提高了培养基的渗透势负值，造成水分逆境，使水分和养分吸收受阻，减少营养消耗。同时抑制细胞壁酶活性，减弱新陈代谢活动，延缓细胞生长[17]。对高浓度渗透压处理下以及恢复生长后SOD、POD活性和MDA含量的变化研究表明，增加渗透压处理后的组培苗SOD、POD活性较对照高，MDA含量较对照低。说明转基因幼苗在增加渗透压后发生生理代谢的协调变化以降低逆境对普那菊苣组培苗细胞膜系统的伤害，增强保护酶的活性，从而增强植株对环境的抗逆性，延缓衰老，达到提高逆境生存能力的目的。