不同石漠化程度对灌丛草地土壤细菌遗传多样性的影响

陈 莹, 王 茜, 王子苑, 王小利

(贵州省草业研究所， 贵州 贵阳 550006)

贵州处于我国的西南部，是喀斯特地貌的核心部位，沉积了巨厚的碳酸盐为主要的地层，出露面积占全省总面积的61.9%，素以“喀斯特博物馆”著称[1]。喀斯特石漠化生态系统的典型特征是生境的严酷性和脆弱性，严酷性集中表现为岩石裸露程度高、土层浅薄、保水能力差；生境的脆弱性表现在土地承载力低、稳定性差、抗干扰能力弱且自然恢复慢[2]。随着石漠化的加剧，植被种类、土壤肥力、土壤微生物等都发生了相应的变化[3-5]，其中土壤微生物积极参与土壤物质的转化过程，是土壤中物质转化的动力，如固氮作用、硝化作用、腐殖质分解作用等，在土壤的形成、肥力演变、有毒物质净化方面起着重要作用[6]。土壤中的微生物是敏感群体，周围环境发生变化就会对其产生相应的影响[7]，细菌是微生物的主要类群，他个体小、数量多、繁殖快，在土壤的物质循环中起着关键作用。因此土壤细菌的多样性可以作为评价土壤生态系统变化的敏感指标和表征土壤质量的生物学指标，对土壤的可持续利用具有重要意义[8-10]。

近年来，变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是研究土壤微生物群落的有效工具，它直接分离土壤微生物的DNA片段，突破了传统的微生物分离纯化培养方法与显微技术的局限性，已成为研究土壤微生物的重要手段之一[11-13]。Muyzer等最先采用PCR-DGGE研究微生物种群图谱，发现这种方法能够用于考察未知微生物群落的遗传多样性[14]。宋铁英[15]认为通过DGGE法检测稻田蓝细菌的遗传多样性，可以避免因纯化、培养以及人为经验判断等因素造成的误差，更能准确的判断蓝细菌的多样性。因此，本研究应用PCR-DGGE技术，对贵州不同程度石漠化灌丛草地土壤细菌的遗传多样性进行了分析，并探讨了不同石漠化程度对土壤细菌遗传多样性的影响，有助于提高对灌丛草地生态系统功能演变的调控和预警能力，为灌丛草地资源的合理利用与保护管理以及退化草地生态系统的恢复重建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

贵州省普定县陈家寨村位于贵州中部偏西，E 105°49′7″，N 26°20′44″，石灰岩山地面积大，石漠化程度多样，占全县总面积的35%左右，取样地海拔1 300～1 400 m，植被以灌丛草地为主，草本植物耐旱的种类较多，包括鬼针草(Bidenspilosa)、酢浆草(Oxaliscorniculata)、千里光(SenecioscandensBuch)、白茅(Imperatacylindrica)等。灌木主要为刺梨(RosaroxburghiiTratt)、小果蔷薇(RosacymosaTratt)、野拔子(ElsholtziarugulosaHemsl)、马桑(CoriarianepalensisWall)、火棘(Pyracanthafortuneana)等，样地土壤均为黑色石灰土。

图1 潜在(A)、轻度(B)、中度(C)、重度(D)石漠化样地Fig.1 Soil samples of potential rocky desertification(A), slight rocky desertification(B), medium rocky desertification(C) and severe rocky desertification(D)

1.2 土壤样品采集

于2014年8月在普定县陈家寨村进行取样，根据岩石裸露程度，选择潜在(A)、轻度 (B)、中度(C)和重度(D)4种石漠化典型样地，以岩石缝玉米耕作地作为对照(E)，利用多点混合采样法在深度为0～20 cm的土层进行取样，取样后放置于无菌保鲜袋中冷藏送回。

1.3 土壤微生物DNA提取

去除土样里面的石子与植物残体，过夜培养的细胞菌液中加入溶菌酶溶液，水浴后加入20 μL Proteinase K溶液，使细胞裂解，接着加入200 μL Buffer BD，200 μL 乙醇混匀，转移至吸附柱中，静置离心，弃废液，加入500 μL PW Solution，离心弃废液，加入500 μL Wash Solution，离心，倒掉滤液，最后取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL离心管中，加入50 μL CE Buffer静置3 min，12 000 rpm室温离心2 min，收集 DNA溶液。

1.4 细菌16S rDNA片段的PCR扩增

以样品基因组DNA为模板，采用细菌通用引物GC-338F和518R扩增样品16S rDNA高变区序列。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR扩增体系(50 μL)为：10×PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mM)3.2 μL；rTaq(5 U·μL-1)0.4 μL；GC-338F(20 mM)1 μL；518R(20 mM)1 μL；模板DNA 50 ng；补ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃复性45 s，72℃延伸1 min，30个循环；最终72℃延伸10 min。PCR产物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

1.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析

取10 μL PCR的产物进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析。采用变形梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶(化学变性剂为100%尿素7 mol·L-1和40%(v/v)的丙烯酰胺)在1×TAE缓冲液中150 V 60℃下电泳5 h。变性梯度凝胶电泳(DGGE)完毕后,采用银染法染色。

1.6 DGGE图谱中优势条带的回收与测序

采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带，以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。将扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到Pmd18-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，菌液由华大基因对插入的细菌16S rDNA片段进行序列测定。

1.7 数据分析

细菌多样性指数是研究群落物种数和个体数以及均匀度的综合指标。根据电泳图谱中样品条带数目及每个条带的强度(灰度)，对各样品中细菌多样性指数(H)、均匀度(E)和丰富度(S)等指标进行分析，计算方法如下：

其中，pi为样品中单一条带的强度在该样品所有条带总强度中所占的比率，N为DGGE图谱单一泳道上所有条带的丰度，Ni为第i条带的丰度；S是某样品中所有条带数目总和。在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA5软件，Neighbor-joining法构建系统发育树，自展数(bootstrap)为1 000。

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA的PCR扩增

提取5份混合土样的土壤总DNA，经测定DNA片段在20 kb左右，OD260/OD280比值在1.82～1.95之间，说明所提DNA的纯度较好，并以GC-338F和518R为引物扩增16S rDNA序列，得到约200 bp的DNA片段(图2)用于DGGE分析。

图2 细菌16S rDNA的PCR扩增Fig.2 Amplification of the 16S rDNA in bacteria

2.2 PCR产物的变性梯度凝胶电泳

如图3所示， 5个土样的图谱在条带上的数目与位置并不一致，与对照玉米耕作地(E)相比，随着石漠化程度的加强，条带数目减少，而潜在石漠化土样(A)的条带最多，说明土壤细菌群落对环境有一定的选择性。

图3 DGGE指纹图谱及Quantityone 软件做的模式图Fig.3 The DGGE fingerprinting and the mode chart made by Quantityone software

2.3 各样品之间的细菌群落结构相似性

通过UPGMA算法对图谱作出的系统树状图如图4所示，我们可以看出5种类型的样地分为2大族群，玉米耕作地(E)单独为1个族，而剩下的4个样地为1个大族。其中潜在(A)与轻度(B)石漠化土壤细菌PCR-DGGE图谱相似度较高，而中度(C)与重度(D)石漠化相似度较高，说明随着石漠化程度的加强，土壤的细菌群落有一个逐渐演替的过程。

图4 依据样品间的相似系数构建的聚类图Fig.4 The cluster dendrogram of the samples

2.4 不同石漠化土样中细菌多样性的分析

5个不同石漠化样地的细菌多样性分析如表2所示，可见5个样地的细菌香农指数与丰富度指数存在一定差异，随着石漠化程度增强，均呈现一定的下降趋势，均匀度指数的差别不大。说明随着石漠化程度的增强与土壤细菌群落的多样性和丰富度成负相关。而玉米耕作地的土壤细菌香浓指数、均匀度指数与丰富度指数最低，这表明土壤耕作后土壤中细菌的复杂度与丰富度显著下降。

表2 各样品之间的细菌多样性分析Table 2 Analysis of bacteria diversity of sample

2.5 主要电泳条带的序列测定

选取5个样品在DGGE凝胶中特异的10个条带，回收后，以338F/518R为引物进行PCR扩增，获得约200 bp的DNA片段。PCR产物纯化后连接到pMD18-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，每个回收条带选取3个克隆进行序列测定，共获得了30个片段的核苷酸序列，所有序列与GenBank数据库中序列的同源性为84%～100%，且大部分与数据库中已知序列同源性低于97%，属于分类在“种”地位上新发现细菌。测试结果显示30个克隆分属于Anaerolineae(厌氧绳菌纲)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)4大类群，其中第1个条带存在2种不同的细菌菌株信息，这说明同一个条带可能含有不同的菌种，用MEGA4.0分析了序列有差异的13个片段，通过GenBank中Blast程序所获近似序列进行菌株的系统发育分析，结果如图4所示，13个序列片段聚成了10个分支，分别属于Geobacter(地杆菌属)，Blastocatella，Chitinophaga，Ferruginibacter，Thioalbus，Lysobacter(溶杆菌)，Terrimonas，Bizionia，Anaerolinea(厌氧绳菌属)，Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)，说明这5种土样中的细菌具有高度的遗传多态性与复杂的群落结构。

图4 16s rDNA序列系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed by 16S rDNA sequences

3 讨论与结论

3.1 不同石漠化程度对土壤细菌群落的影响

土壤微生物在土壤的形成与发育、物质的转化与能量的传递等过程中发挥着重要作用，并与土壤肥力及土壤的健康有着密切的关系，是评价土壤质量的重要指标之一[16-18]。何寻阳[19]研究发现影响土壤微生物群落结构的因素很多，但是最重要的因素是有机质的复杂性与数量，它提供了大量的碳、氮资源，而植被的变化必然会导致土壤有机质的改变，从而引起土壤微生物组成、活性与代谢功能发生改变。张平究[20]在研究植被恢复对喀斯特土壤生化特性的影响中发现，植被恢复显著地提高了土壤养分、微生物活性、细菌种群丰富度及基因多样性，植被恢复演替下土壤细菌群落结构之间的多样性遵循如下趋势:裸露地<(稀)草地<灌丛。这说明随着喀斯特环境植被恢复的变化，土壤微生物种类及其多样性也会随之改变。本研究结果显示：与对照玉米耕作地(E)相比，随着石漠化程度的加强，地上植被从灌木逐渐演替到草本植物，植被种类、数量显著减少，而通过DGGE指纹图谱进行分析，条带数目随石漠化程度加深而减少，潜在石漠化土样(A)的条带最多，5个样地的细菌香农指数和丰富度指数与石漠化程度成负相关，而玉米耕作地土壤细菌香指数、均匀度指数与丰富度指数最低，这与张平究的研究结果类似，说明随着石漠化程度的加剧，地面裸露程度增加，导致地面植被种类、盖度随之减少，进而影响到土壤一系列的生化反应，导致土壤中参与生化反应的细菌种类和数量发生了改变。另一方面，在石漠化地区的土地上进行农业耕作，降低了土壤细菌群落多样性，对土壤微生物群落结构带来了负面的影响。

3.2 土壤细菌遗传多样性对不同石漠化的响应

本研究选取5个样品在DGGE凝胶中特异的10个片段进行克隆测序，每个片段选择3个克隆进行序列测定，结果显示，克隆片段在系统发育分析中聚成10个分支，说明土壤细菌在不同程度石漠化土壤中会形成不同的种类，随着石漠化程度的加重，细菌群落结构发生了很大的变化，并且改变了土壤细菌群落的遗传多样性，但值得注意的是，没有检测到的细菌类群不能归纳为没有，因为本文只是选择部分克隆用于分析和测序，这里细菌多样性的比较与其说是反映土壤细菌群落多样性，不如说是反映细菌群落的物种丰度[21]。本研究在构建克隆文库中，超过一半序列是属于新的“种”分类上的细菌，对这些新细菌的进一步研究，将有助于揭示石漠化生态系统功能退化的微生物机理。

综上所述，本试验结果显示石漠化程度越严重，土壤中的细菌群落复杂性与多样性越低，在不同程度石漠化灌丛草地土壤中细菌会形成不同的群落结构，并具高度的遗传多样性。另一方面，在石漠化土地上进行农耕作业会明显降低土壤中细菌的丰富度与多样性，这会影响土壤的肥力，并对土壤的健康状态带来负面的影响，因此在制定石漠化恢复的措施时，要考虑到土壤微生物对生态系统的重要作用，采用多种植物混播的培育模式。