TREK- 1阻滞剂SID1900对CUMS小鼠突触发生的调节作用

王梅蕾，吴芳芳，张志珺

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 神经内科，江苏 南京 210009)

TREK- 1阻滞剂SID1900对CUMS小鼠突触发生的调节作用

王梅蕾1，吴芳芳2，张志珺2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学附属中大医院 神经内科，江苏 南京 210009)

目的：探讨钾离子通道(TREK- 1)阻滞剂SID1900对海马区域突触发生的调节作用及其可能的抗抑郁作用分子机制。方法：选用8～10周龄C57BL/6J雄性小鼠进行慢性不可预知温和应激(CUMS)造模，造模成功后给予TREK- 1阻滞剂Spadin、SID1900连续28 d腹腔注射，分别于给药0、7、14、21、28 d对小鼠进行行为学测试,通过Western blotting方法检测突触相关蛋白PSD95、Synapsin 1表达水平变化。结果：CUMS小鼠蔗糖水消耗百分比较对照组显著降低，强迫游泳中不动时间显著升高，出现抑郁样表型；给药3周后，Spadin、SID1900可以使CUMS小鼠蔗糖水消耗百分比升高，但较对照组仍然降低，对开场、强迫游泳实验结果无显著影响；给药4周后，Spadin、SID1900使CUMS小鼠蔗糖水消耗百分比升高，且与对照组无差异，在强迫游泳、悬尾实验中的不动时间缩短；Western blotting检测显示，给药4周后CUMS小鼠突触相关蛋白PSD95、Synapsin 1表达升高。结论：TREK- 1阻滞剂SID1900可改善抑郁症状，使突触相关蛋白PSD95、Synapsin 1表达升高，影响突触发生可能是其抗抑郁作用机制之一。

钾离子通道； 通道阻滞剂； 突触发生； 抗抑郁治疗； 小鼠

抑郁症是一种以显著而持久的情绪低落、快感缺失和兴趣活动减少为主要临床特征的心境障碍[1]。据世界卫生组织预计，到2030年抑郁症将成为全球范围内因病致残的主要原因[2]。目前临床上常用的抗抑郁药物主要通过引起突触间隙单胺递质浓度快速发生改变而产生抗抑郁作用，但其临床效果却滞后数周甚至数月，因此我们需要研究能够快速起效的抗抑郁药物及其作用机制。近来研究发现，双孔钾离子通道家族中的一种弱内向整流双孔钾通道相关的机械门控性双孔钾离子通道(TWIK- related K+channel,TREK- 1)与抗抑郁治疗之间存在一定的联系。阻滞TREK- 1可产生抗抑郁表型，TREK- 1拮抗剂Spadin亚急性给药4 d后可显著缩短小鼠在强迫游泳实验(force swimming test，FST)、悬尾实验(tail suspension test，TST)中的不动时间，也可促进海马区域突触发生相关蛋白PSD95、Synapsin1生成[3- 5]。本研究组与中国科学院上海药物研究所合作筛选的SID1900能够有效地阻滞TREK- 1，且研究证实连续给予CUMS大鼠腹腔注射SID1900 14 d能显著改善大鼠抑郁样症状。SID1900起到抗抑郁作用主要通过阻断中缝背核5- 羟色胺能神经元上TREK- 1从而增强该神经元兴奋性，促进5- 羟色胺递质传递，进而上调PKA- CREB- BDNF信号达到抗抑郁效应[6]。虽然研究证实SID1900可以通过影响5- 羟色胺递质系统达到抗抑郁效应，但不能排除其通过其他机制起到抗抑郁作用。既往研究证实TREK- 1拮抗剂Spadin可以通过影响海马区域突触发生起到抗抑郁作用，表现为Synapsin1、PSD95等突触相关蛋白功能及表达的改变[5]。本研究我们主要观察SID1900给药后对突触发生相关蛋白PSD95、Synapsin1的影响来判断其对突触发生的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用8～10周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠，单笼饲养5只小鼠，每天给予小鼠12 h光照(光照时间08:00～20:00)，通风良好，室温控制在(21±2) ℃，湿度55%。适应性饲养1周，期间训练小鼠饮用蔗糖水、游泳。小鼠饲养及动物实验遵守国家健康指导中心发布的实验动物管理及使用规定[7]。

1.2 实验动物分组

(1) 对照组：正常条件下饲养，不给予任何干预因素；(2) CUMS模型组(CUMS 1组)：给予CUMS应激刺激；(3) CUMS+SID1900组(CUMS 2组)：给予CUMS应激刺激及SID1900干预；(4) CUMS+Spadin组(CUMS 3组)：给予CUMS应激刺激及Spadin干预。

1.3 应激抑郁模型建模方法

以慢性不可预见性的温和应激刺激结合孤养法制备抑郁症动物模型，造模过程包括以下9种应激刺激。(1)禁食：持续12 h；(2)禁水：持续12 h；(3)湿笼：均匀倾洒约200 ml清水于鼠笼垫料上，持续12 h后，打扫鼠笼，换上干燥垫料；(4)斜笼：倾斜鼠笼45°，持续12 h；(5)通宵照明：打开两管40 W的白炽灯，于20:00至次日8:00光照，确保每只老鼠均置于灯光照射下，以模拟昼夜颠倒；(6)行为限制：将小鼠置于50 ml的离心管中6 h，限制其运动；(7)合笼：将相邻两笼的老鼠置于同一笼中，持续8 h；(8)频闪光照(300 次·min-1)：持续8 h；(9)禁食、禁水：持续12 h。每日给予2～3种刺激，同种刺激不连续出现，顺序随机，使动物不能预料刺激的发生，应激共历时8周。除正常对照组外其它实验小鼠均为单笼饲养[8]。

1.4 给药方法

根据小鼠体质量，SID1900、Spadin分别按照7 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1[9]剂量每日16:00给药1次，持续4周，CUMS组同时给予同等量生理盐水4周，给药方式为腹腔注射。

1.5 动物行为学评估

1.5.1 蔗糖水偏好实验(sucrose preference test, SPT) 在安静的环境中给予小鼠已经称质量的1%蔗糖水与纯水，随机摆放蔗糖水与糖水的顺序，12 h后调换蔗糖水与纯水位置，24 h后测量剩余液体的质量，计算小鼠蔗糖水偏好百分比[10]。

1.5.2 强迫游泳实验 将小鼠放入内径15 cm、高30 cm的玻璃圆桶中，水深15 cm，水温(22±1) ℃，实验记录小鼠在水中6 min活动状态，评价分析后4 min内小鼠的不动时间。累计小鼠的漂浮不动时间作为判断抑郁严重程度的指标[4]。

1.5.3 悬尾实验 将小鼠尾部1 cm的部位贴在一垂直地面的木棍上，头离地50 cm，使动物呈倒挂状态，用挡板隔开动物的视线，动物为克服不正常体位而挣扎活动，但活动一段时间后出现间歇不动状态，显示绝望状态，以连续3 s以上的不动时间为有效不动时间，不动状态即小鼠停止挣扎不动或无任何活动，悬挂时间为6 min，统计后4 min内累计不动时间[11- 13]。

1.5.4 开场实验(open- field test, OFT) 将小鼠置于开场箱中，开场实验箱规格为50 cm×50 cm×50 cm，底板及四壁为白色，上部开敞，追踪小鼠的自发活动情况。本试验将自发活动箱划分为16宫格，其中中间6、7、10、11定义为中央格区域，其他为边角区域，记录小鼠在边角活动路程[14]。

1.6 蛋白表达测定

给药28 d后提取小鼠海马蛋白，采用Western blotting方法检测突触相关蛋白PSD95、Synapsin 1表达水平变化。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 CUMS造模对小鼠行为学影响

CUMS建模8周时，与对照组[(87.07±2.91)%]相比，CUMS 1组[(79.42±6.78)%]、CUMS 2组[(73.38±8.05)%]、CUMS 3组[(74.94±10.38)%]小鼠的蔗糖水消耗百分比显著减低，差异有统计学意义(F3,36=7.17，P<0.05)；与正常对照组[(54.75±34.42)s]相比，CUMS 1组[(129.47±22.10)s]、CUMS 2组[(130.22±30.88)s]、CUMS 3组[(131.59±32.99)s]在强迫游泳实验中不动时间显著增加，差异有统计学意义(F3,36=17.25，P<0.001)。造模后小鼠出现抑郁样表型。

2.2 药物干预3周对小鼠行为学影响

药物干预3周时，与CUMS 1组[(70.66±4.46)%]相比，CUMS 2组[(77.58±5.20)%]、CUMS 3组[(78.69±6.69)%]小鼠的蔗糖水消耗百分比显著升高;但与对照组[(83.98±2.83)%]相比，CUMS 2组、CUMS 3组小鼠的蔗糖水消耗百分比仍有所降低，差异有统计学意义(F3,36=13.92，P<0.001)。与CUMS 1组[(119.22±30.32)s]相比，CUMS 2组[(103.19±27.08)s]、CUMS 3组[(119.86±28.63)s]小鼠在强迫游泳实验中不动时间未见明显改善(P值分别为0.96、0.23)。与CUMS 1组[(1 031.12±123.03)cm]相比，CUMS 2组[(1 014.89±120.8)cm]、CUMS 3组[(920.66±99.70)cm]小鼠药物干预后的角落活动路程未见明显改善(P值分别为0.06、0.77)。

2.3 药物干预4周对小鼠行为学影响

药物干预4周时，与CUMS 1组[(80.77±5.63)%]相比，CUMS 2组[(87.29±3.37)%]、CUMS 3组[(87.29±3.37)%]小鼠的蔗糖水消耗百分比显著升高;与对照组[(85.46±3.85)%]相比，CUMS 2组[(87.29±3.37)%]、CUMS 3组[(87.29±3.37)%]小鼠的蔗糖水消耗百分比显著升高(F3,36=6.61，P<0.05)。与CUMS 1组[(108.37±22.97)s]相比，CUMS 2组[(69.80±25.12)s]、CUMS 3组[(75.50±28.96)s]小鼠在强迫游泳实验中不动时间显著减少，差异有统计学意义(F3,36=8.76，P<0.001)。与CUMS 1组[(188.29±26.01)s]相比，CUMS 2组[(139.69±29.32)s]、CUMS 3组[(138.92±22.93)s]小鼠在悬尾实验中不动时间显著减少，差异有统计学意义(F3,36=6.63，P<0.05)。

2.4 药物干预4周对海马突触发生相关蛋白PSD95表达的影响

药物干预4周时，与正常对照组(0.87±0.162)相比，CUMS1组(0.35±0.113)小鼠海马区域PSD95相对表达量显著降低(P<0.05)；与CUMS1组相比，CUMS2组(0.91±0.291)、CUMS3组(1.02±0.442)小鼠海马PSD95相对表达量显著增加(F3,12=4.501，P<0.05)。见图1A。

2.5 药物干预4周对海马突触发生相关蛋白Synapsin1表达的影响

药物干预4周时，与正常对照组(0.92±0.110)相比，CUMS1组(0.58±0.120)小鼠海马Synapsin1相对表达量显著降低(P<0.05)；与CUMS1组相比，CUMS2组(1.21±0.187)、CUMS3组(0.90±0.336)小鼠海马Synapsin1相对表达量显著增加(F3,12=6.183，P<0.05)。见图1B。

与对照组比较,aP<0.05；与CUMS组比较,bP<0.05

图1 药物干预4周时对海马突触相关蛋白表达水平影响

Fig 1 The effect of drug intervention on the protein level of two markers of synaptogenesis in 4 weeks

3 讨 论

目前抑郁症的病因尚不清楚，其主要发病机制包括单胺递质缺乏假说、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能失调假说、第二信使失衡假说、神经营养失衡假说、突触发生假说等[15- 16]。临床上常用的抗抑郁药物主要以单胺类神经递质缺乏假说为基础，包括三环类药物、选择性5- 羟色胺再摄取抑制剂、选择性去甲肾上腺素再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂等，尽管经典的抗抑郁药物有一定的疗效，但其起效慢、治疗效果滞后、超过三分之一的患者出现治疗耐受现象、副作用明显等缺点造成患者依从性下降、病情反复[17]。经典抗抑郁药物能引起突触间隙单胺递质浓度快速发生改变，但其临床效果却滞后数周甚至数月，因此我们需要发现不同于经典抗抑郁药物的新型抗抑郁剂。近来研究发现,双孔钾离子通道家族中的TREK- 1与抗抑郁治疗之间存在一定的联系。TREK- 1高表达于人类、小鼠前额皮层、海马区域[18- 19]，阻滞TREK- 1可产生抗抑郁表型[3- 5]。既往研究证实TREK- 1拮抗剂Spadin可通过影响海马区域突触发生起到抗抑郁作用，因此本研究探究TREK- 1阻滞剂SID1900的抗抑郁作用以及其对突触发生的调节作用。研究中我们选用CUMS建立抑郁模型，通过模拟人类日常生活中慢性低水平应激促发小鼠抑郁状态发生，模型建立成功与否直接关系本实验成功与否。CUMS中应激因子的多变性、不可预见性是建模成功的关键。本研究在建模8周后对CUMS小鼠进行行为学检测发现，CUMS组小鼠较正常对照组小鼠蔗糖水偏好程度显著降低(P<0.05)，呈现出抑郁症的核心症状“快感缺失”，在FST中小鼠出现了挣扎时间降低的绝望状态，这均符合抑郁症动物模型建立的表面效度[20]。行为学检测显示实验中的模型动物出现的抑郁状态与抑郁症患者的临床表现有较高程度的相似性，CUMS模型建立较为成功。

小鼠强迫游泳和悬尾两种行为测试是在实验中通过给小鼠提供一个不可逃避的压迫环境，使小鼠表现出挣扎或者不动状态来反映小鼠的绝望程度，开场实验是用于评价动物自发活动以及焦虑状态的经典行为学实验，能对动物的自发行为、探索行为和焦虑状况进行定量评价，是常用的抗抑郁药物筛选评价模型，但这几种行为学测试本身对小鼠存在一定的应激刺激作用。蔗糖水偏好实验可用来检测动物对奖赏的反应性，对奖赏的不敏感或快感缺失是慢性不可预知温和应激模型的核心症状，蔗糖水偏好实验对小鼠本身不存在一定的应激刺激；若每周都对小鼠进行4种行为学测试，则CUMS造模会受一定影响，所以在实验过程中我们未对小鼠进行每周的行为学测试，而是在蔗糖水实验结果有显著差异时选取FST、TST、OFT当中的两种行为学实验同时进行评估实验动物抑郁状态的改善情况，避免对小鼠产生不必要的应激刺激。

Jean Mazella等使用Spadin干预小鼠后的行为学数据显示,Spadin干预4 d后可显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间；而本实验中Spadin干预3周可改善小鼠蔗糖水消耗降低现象，干预4周才显著缩短小鼠在强迫游泳实验中的不动时间。实验结果存在一定的差异，这可能是由于两个实验中所干预的实验对象存在差异：文献报道中干预的小鼠为正常小鼠，而本实验中干预的对象为CUMS抑郁模型小鼠，因为抑郁状态小鼠与正常状态小鼠脑内突触状态有一定的差异，对抗抑郁药物的反应也很可能不同，此外文献报道中的药物给药方式是侧脑室给药，而本实验中的给药方式为腹腔注射，吸收途径不同也可能是两种研究存在差异的原因。本研究组以往研究发现,SID1900干预CUMS抑郁样大鼠2周可明显改善大鼠行为学，与本实验研究结果存在一定的差异，可能是由于干预的物种存在一定的差异，小鼠相比于大鼠比较容易激惹，在行为学测量时各个个体之间的差异较大，数据分布较散，误差较大。

突触是指一个神经元的轴突和树突及其全部分支与另一个神经元肌细胞、腺细胞以及其他效应器细胞或感受器细胞等紧密接触并形成特殊结构的功能接触部位。神经元之间准确无误的信息交换在一定程度上是通过突触部位实现的。突触发生是神经系统发育中非常重要的一步，包括形态学与功能结构改变。本研究结果提示,TREK- 1阻滞剂SID1900腹腔注射28 d后可使CUMS小鼠海马区域突触发生相关蛋白表达显著升高，突触功能发生改变，其可能为SID1900产生抗抑郁效应的机制。本实验中只观察TREK- 1阻滞剂SID1900对突触相关蛋白表达的影响，并未对突触形态学改变进行检测。使用TREK- 1阻滞剂Spadin干预体外培养的神经元会使成熟树突棘所占比例升高，即蘑菇状树突棘数目增多[14]。在后续研究中我们将观察SID1900对突触形态学的影响。Spadin通过激活ERK1/2、Akt分子信号途径从而对突触发生产生影响，接下来我们有必要进一步研究SID1900是否通过该分子信号途径对突触发生产生调节作用从而发挥抗抑郁效应。

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Regulatory effects of TREK- 1 blocker SID1900 on synaptogenesis of chronic unpredictable mild stress mice

WANG Mei- lei1,WU Fang- fang2,ZHANG Zhi- jun2

(1.SchoolofMedicine,SoutheastUniversity,Nanjing210009,China; 2.DepartmentofNeurology,ZhongdaHospital,SoutheastUniversity,Nanjing210009，China)

Objective: To investigate the regulatory effects of TWIK- related K+channel(TREK- 1) blocker SID1900 on synaptogenesis in hippocampus in order to explore the anti- depression mechanism. Methods: Adult male C57BL/6J mice of 8 to 10 weeks were chosen to set up chronic mild unpredictable stress- induced anhedonia model of depression, and TREK- 1 blocker of Spadin and SID1900 was injected for 28 days, and antidepressant response of TREK- 1 blocker was evaluated on chronic unpredictable mild stress model by sucrose preference test, tail suspension test, force swimming test, open field test. On dosing 0, 7, 14, 21, 28 days. We extracted the post- synaptic density protein of PSD95 and synapsin1 in hippocampus on days of 28, then detected protein level of two markers synaptogenesis protein with Western blotting. Results: The chronic mild unpredictable stress significantly decreased the sucrose preference of model mice, and the time of immobility in FST was significantly increased compared with the control mice,the CUMS mice expressed specific endophenotype of depression. Chronic treatement with Spadin or SID1900 significantly increased the sucrose preference at the end of three- week treatment compared with the CUMS mice, but still decreased compared with the control mice, and the chronic three- week treatment did no affect force swimming test and Open- field test. Chronic treatement with Spadin or SID1900 significantly increased the sucrose preference at the end of four- week treatment compared with the CUMS mice, but there was no difference compared with the control mice. The immobility time in force swimming test and tail suspension test significantly decreased compare with the CUMS mice. Chronic treatement with Spadin or SID1900 for four weeks also increased protein level of two markers of synaptogenesis, the PSD95 and synapsin1 in the hippocampus. Conclusion: TREK- 1 blocker (SID1900) can improve depressive symptoms and increase the expressions of synapse associated proteins PSD95 and Synapsin 1, which maybe the antidepression mechanism of TREK- 1 blocker.

potassium channel； channel blocker； synaptogenesis；anti- depression; mice

2017- 03- 16

2017- 05- 04

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81402910)

王梅蕾(1988-)，女，江苏盐城人，在读硕士研究生。E- mail:15298365518@163.com

张志珺 E- mail:linyong63@163.com

王梅蕾，吴芳芳，张志珺.TREK- 1阻滞剂SID1900对CUMS小鼠突触发生的调节作用[J].东南大学学报：医学版，2017，36(4)：513- 518.

R- 332; R338.26

A

1671- 6264(2017)04- 0513- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.002