玉米须多糖中糖醛酸含量的测定及抗氧化作用的研究

赵鹤鹏，许秋达，周鸿立

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

玉米须多糖中糖醛酸含量的测定及抗氧化作用的研究

赵鹤鹏，许秋达，周鸿立*

（吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022）

研究玉米须多糖中糖醛酸的含量测定方法和抗氧化作用。采用间羟基联苯法在528 nm处测定糖醛酸含量，利用4种抗氧化方法测定玉米须多糖的抗氧化活性。标准半乳糖醛酸质量浓度在20～100 μg/mL之间与吸光度呈良好的线性关系，测得标准曲线为y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4，平均加样回收率为100.43%，RSD为1.51%，玉米须多糖中糖醛酸含量为59.21 μg/mg。玉米须多糖清除羟基自由基、DPPH和超氧阴离子的IC50分别为0.99 mg/mL，0.44 mg/mL和6.05 mg/mL。间羟基联苯法简便易行、准确性高、重现性好，且多糖4种体系的抗氧化试验均证明其具有一定的抗氧化能力，均弱于Vc，得出玉米须多糖中糖醛酸含量与抗氧化活性呈正相关。

玉米须多糖；糖醛酸；间羟基联苯法；抗氧化作用

0 引言

玉米须是禾本科作物玉米的干燥花柱和柱头，又名棒子毛，为常用药材品种之一。现代药理研究证实，玉米须有降血糖、降血压、抗肿瘤、抗氧化、抗癌、增强免疫功能、延缓衰老等作用，其中化学成分主要有多糖、甾醇、生物碱、有机酸、黄酮、多元醇、氨基酸等[1]。其中黄酮和多糖含量比较丰富。玉米须多糖主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、甘露糖和木糖所组成[2]。由于植物多糖按化学性质可分为中性多糖和酸性多糖，后者由于结构中引入了糖醛酸等基团而具有酸性和相应的特殊药效。之前采用咔唑－硫酸法[3]和间羟基联苯法[4]测定植物多糖中糖醛酸的含量，研究结果表明，采用咔唑－硫酸比色法时，由于待测溶液中的中性单糖、戊糖和己糖与糖醛酸的吸收波长相同[5]，会使得糖醛酸的测定值偏离实际含量。而采用间羟基联苯法测糖醛酸含量更接近理论值。申明月等[6]采用液相色谱法测定糖醛酸含量发现，不同多糖的抗氧化活性与其糖醛酸含量呈正相关，糖醛酸含量越高，其抗氧化能力越强。本实验研究玉米须多糖中糖醛酸含量的测定方法，并验证其与抗氧化活性的相关性。

1 试验方法

1.1 仪器与试剂

SHB－IIIA循环水式多用真空泵、752紫外可见分光光度计、FA－2004型分析天平、LDZ5－2型台式离心机等。

玉米须采自吉林省吉林市玉米田，经干燥处理后备用；咔唑（Aladdin）、半乳糖醛酸（国药集团）、1，1－二苯基苦基苯肼（Sigma）、 间羟基联苯（Aladdin）、30%双氧水（Aladdin）等试剂均为分析纯。

1.2 糖醛酸的含量测定

1.2.1 溶液的配制

对照品溶液：精确称取70℃干燥至恒质量的半乳糖醛酸对照品4 mg置于50 mL容量瓶中，以蒸馏水溶解定容，配成80 μg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：分别精确称取玉米须多糖50 mg，置于50 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，离心（10 min，3 000 r/min），配成 1 mg/mL 的多糖溶液。

硼砂－硫酸溶液：称取0.477 g硼砂加入浓硫酸100 mL超声溶解，备用。

间羟基联苯溶液：称取间羟基联苯0.15 g，用0.5%氢氧化钠溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。

1.2.2 测定波长的选择

采用阿里红多糖中糖醛酸的含量测定[7]方法进行测定，精确移取80 μg/mL半乳糖醛酸0.5 mL于10 mL容量瓶中，缓慢加入5 mL硼砂－硫酸溶液，摇匀后，至沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温后，加入0.15%间羟基联苯溶液80 μL，混匀，静置30 min。蒸馏水同上操作制得空白液调零，在400～800 nm波长扫描，确定最大吸收波长为528 nm。结果如图1所示。

图1 全波长扫描图Fig.1 Full wavelength scanning of corn silk polysaccharides

1.2.3 标准曲线的制备

分别精确吸取半乳糖醛酸对照品溶液 2、3、4、5、6 mL于5个10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。取系列浓度半乳糖醛酸标准溶液1 mL，其余同1.2.2。

1.2.4 方法学考察

对半乳糖醛酸标准曲线进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率等试验考察，之后测定玉米须多糖中糖醛酸的含量。

1.3 抗氧化试验

1.3.1 清除羟基自由基能力的测定

取2.0 mmol/L邻二氮菲40 μL于酶标仪板中，依次加入 PBS（pH 7.40）40 μL，蒸馏水 20 μL，充分混匀后，加入0.75 mmol/L硫酸亚铁20 μL，混匀，加质量分数为0.12%的H2O220 μL，于37℃恒温箱中保存60 min，在505 nm处测定其吸光度；用蒸馏水代替H2O2，测定其吸光值；取系列浓度梯度的玉米须多糖溶液代替蒸馏水20 μL，测定其吸光值[8]。用VC溶液作阳性对照。

1.3.2 总还原能力的测定

依次在10支10 mL试管中加入系列浓度梯度的玉米须多糖溶液1.0 mL，磷酸盐缓冲溶液（pH=6.6）2.5 mL和1%铁氰化钾2.5 mL，置于50℃水浴中反应20 min，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混匀后以 3 000 r/min离心 10 min，取上清液2.5 mL，加入0.1%三氯化铁溶液0.5 mL和2.5 mL的蒸馏水，摇匀后在700 nm处测定吸光值，平行测定3次取平均值[9]。用VC溶液作阳性对照。

1.3.3 清除DPPH自由基能力测定

取系列浓度梯度的玉米须多糖溶液100 μL于酶标仪板中，加入等体积浓度为0.5 mmol/L的DPPH溶液（无水乙醇配制），混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度。取上述浓度梯度的玉米须多糖溶液100 μL加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光度，平行测定3次取平均值。空白对照组为100 μL DPPH溶液加上等体积无水乙醇，在517 nm处测定吸光值[10]。用VC溶液作阳性对照。

1.3.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定

（1）取 50 mmol/L Tris－HCl缓冲溶液 200 μL于25℃恒温箱中预热20 min后，分别加20 μL系列浓度梯度的玉米须多糖溶液和20 μL邻苯三酚，25℃条件下反应5 min，在325 nm处测定吸光值；（2）用 20 μL 10 mmol/L 盐酸代替（1）中的邻苯三酚溶液；（3）用 20 μL 蒸馏水代替（1）中的多糖溶液，分别在25℃条件下反应5 min，在325 nm处测定吸光值[11]。用Vc溶液作阳性对照。

2 结果与分析

2.1 糖醛酸含量的测定

2.1.1 测定波长的选择

由图1可知，对照品和供试品溶液在528 nm处有最大吸收波长。因此选528 nm为测定波长。

2.1.2 玉米须多糖最低检测限的测定

由图1可知，玉米须多糖溶液稀释到0.2 mg/mL时，目测出最低检测限。

2.1.3 标准曲线的制备

在n=5时，得到线性回归方程：y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4。 半乳糖醛酸含量在 20～100 μg/mL之间与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验

取对照溶液在相同的操作条件下，连续操作6次，结果见表1。

表1 精密度试验Table 1 The precision experiment

RSD为1.86%＜3.0%，符合测定紫外分光光度计的要求，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 稳定性考察

为使分析方法可用于常规检验所规定的时间，以确保方法可行，在操作条件下，进行一系列稳定性试验，结果见表2。

表2 稳定性试验Table 2 The stability experiment

RSD为1.77%＜3.0%，表明溶液在80 min内显色稳定，可进行测定。

2.1.4.3 重复性试验

用规定的方法平行测定样本5份，结果如表3所示。

表3 重复性试验Table 3 The repetitive experiment

RSD为1.90%＜3.0%，符合重现性的要求范围。

2.1.4.4 加样回收率试验

为考察其他成分对测定的干扰，分别用咔唑－硫酸法与间羟基联苯法测定其加样回收率，结果见表4。

表4 间羟基联苯法和咔唑－硫酸法加样回收率试验（n=5）Table 4 The recovery test of m－hydroxydiphenyl and carbazole method（n=5）

从表4可以看出，间羟基联苯法的测定结果较之咔唑－硫酸法的测定结果距真实值更为接近。因此，选择采用间羟基联苯法测定玉米须多糖中糖醛酸的含量。

2.2 糖醛酸含量测定

按标准曲线计算得玉米须多糖中糖醛酸含量为 59.21 μg/mg。

2.3 抗氧化试验

2.3.1 清除羟基自由基能力测定

按1.3.1的方法进行试验。计算出不同质量浓度玉米须多糖和Vc对羟基自由基的清除率，结果如图2所示。

图2 多糖和Vc对羟基自由基清除率的影响Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由图2可以看出，二者对羟基自由基清除率随着质量浓度的增加而升高。玉米须多糖对羟基自由基的IC50为0.99 mg/mL，Vc对羟基自由基的IC50为 0.26 mg/mL。

2.3.2 总还原能力测定

按1.3.2方法进行试验，结果如图3所示。

图3 多糖和Vc的总还原能力测定曲线Fig.3 Total reduction ability of corn silk polysaccharide and Vc

由图3可以看出，二者的总还原力随着质量浓度的增加而逐渐升高，但玉米须多糖的还原力比Vc的要低。

2.3.3 清除DPPH自由基能力的测定

按1.3.3的方法进行试验。计算出不同质量浓度下二者对DPPH自由基的清除率，结果如图4所示。

图4 多糖和VC对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由图4可以看出，二者对DPPH自由基清除率随着质量浓度的增加而升高。玉米须多糖对DPPH自由基的IC50为0.44 mg/mL，Vc对DPPH自由基的IC50为0.044 mg/mL。

2.3.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定

按1.3.4的方法进行试验。计算不同质量浓度下二者对超氧阴离子自由基的清除率，结果如图5所示。

图5 多糖和Vc对超氧阴离子自由基清除率的影响Fig.5 Superoxide anion radical scavenging ability of corn silk polysaccharide and Vc

由图5可以看出，二者对超氧阴离子自由基清除率随着质量浓度的增加而升高。玉米须多糖对超氧阴离子自由基的IC50为6.05 mg/mL，Vc对超氧阴离子自由基的IC50为0.54 mg/mL。

3 结论

本文采用间羟基联苯法对糖醛酸含量进行测定，测定结果显示在20～100 μg/mL之间呈良好的线性关系，测得标准曲线为y=0.009 3x+0.005 2，R2=0.999 4，稳定性RSD值为1.77%，精密度RSD值为1.86%，重复性RSD值为1.90%，加样回收率RSD值为1.51%，结果表明此法准确率较高，重复性较好。同时也说明中性糖对测定结果的影响较小，测定出玉米须多糖中糖醛酸的含量为59.21 μg/mg。

玉米须多糖对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的 IC50分别为0.44 mg/mL、0.99 mg/mL、6.05 mg/mL。结果表明玉米须多糖具有一定的抗氧化能力，为玉米须多糖的开发与研究提供了理论依据。

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DETERMINATION OF URONIC ACID IN CORN SILK POLYSACCHARIDES AND ITS ANTIOXIDATION ACTIVITY

ZHAO Hepeng，XU Qiuda，ZHOU Hongli
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin 132022，China）

The present study was to investigate the uronic acid content in the corn silk polysaccharides and its antioxidant activity.The content of uronic acid was determined using 3－phenylphenol colorimetry method at 528 nm，while 4 kinds of classical antioxidant methods were used to examine the antioxidant activity of corn silk polysaccharide.The results showed that a good linearity relation existed between the absorbency and the concentration of standard galacturonic acid in the range of 20～100 μg/mL（y=0.009 3x+0.076 1，r=0.999 1），and the average recovery and RSD were 100.43%and 1.51%，respectively.The content of uronic acids in polysaccharides from corn silk was59.21 μg/mg.The IC50valuesofscavenging ability ofcorn silk polysaccharides on hydroxyl radical， DPPH radicals and superoxide anion radical were 0.99 mg/mL，0.44 mg/mL and 6.05 mg/mL， respectively.It was concluded that the 3－phenylphenol colorimetry method had the advantages of available， accurate and reproducible on the determination of uronic acid.In addition，corn silk polysaccharide had certain antioxidant ability，which was positively correlation with the uronic acid content.This study will provide a theoretical basis for the development and research of corn stigma polysaccharide.

corn silk；uronic acid；3－phenylphenol colorimetry；antioxidation activity

TS201.2

：B

1673－2383(2017)04－0081－05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170828.0857.030.html

网络出版时间：2017－8－28 8:57:23

2017－01－10

吉林省科技厅科研项目（20150311044YY）

赵鹤鹏（1988—），男，吉林省吉林市人，硕士研究生，主要从事天然有机化学的研究工作。

*通信作者