环氧合酶-2蛋白和核因子κB在结肠癌中的表达及相关性研究

温国华，李燕玲，陈倩雅

广州市增城区人民医院1.肿瘤科;2.普外科，广东广州511300

环氧合酶-2蛋白和核因子κB在结肠癌中的表达及相关性研究

温国华1，李燕玲2，陈倩雅2

广州市增城区人民医院1.肿瘤科;2.普外科，广东广州511300

目的 探讨结肠癌中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白和核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)表达及其相关性。方法 选取广州市增城区人民医院结肠癌患者48例作为结肠癌组，同时纳入健康志愿者30名作为对照组。采用逆转录实时定量聚合酶链反应RT-PCR的方法对COX-2蛋白和NF-κB的相对表达量进行检测，分析其表达量与结肠癌之间的关系。结果 结肠癌组COX-2蛋白和NF-κB mRNA的表达均显著高于对照组(P＜0.05);COX-2蛋白和NF-κB在结肠癌转移方面差异有统计学意义(P＜0.05);COX-2蛋白与NF-κB呈正相关。结论 结肠癌COX-2蛋白与NF-κB表达具有相关性，COX-2蛋白和NF-κB相对表达量可作为结肠癌是否转移的预判指标之一。

环氧合酶-2蛋白;核因子κB;相对表达量;结肠癌

近年来，我国结肠癌的发病率不断上升，而且有年轻化的趋势，肿瘤呈现局部侵袭性，且极易发生转移。近二十年来，随着新辅助化疗和综合治疗的临床应用，结肠癌的疗效已经显著提高，但仍有30%以上的患者出现复发和转移，是其死亡的主要原因，因此，研究结肠癌的转移对于改善结肠癌的预后具有重要的临床意义［1］。核因子 κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种重要的核转录因子，已有大量研究证明，NF-κB参与调控细胞发生、发展、分化和凋亡相关的功能性基因及细胞因子基因的表达［2］。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)蛋白是膜结合蛋白，在免疫细胞中，可以特异性地与细胞因子MIF结合，在血管内外激活物激活的条件下可表达，在组织损伤及炎症时表达增加，在肿瘤的发生、发展中有着一定的关系［3］。因此，本课题拟用分子生物学和免疫组织学技术，分析COX-2蛋白和NF-κB在结肠癌患者中的表达情况，探讨其与结肠癌表达的关系，总结COX-2蛋白和NF-κB是否可作为结肠癌早期诊断、术前辅助诊断和病情监测标记物，研究COX-2蛋白和NF-κB与结肠癌转移的关联性，为结肠癌的早期诊治提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月-2015年1月广州市增城区人民医院普外科行结肠癌手术的患者48例作为结肠癌组，同时纳入健康志愿者30名作为对照组。对结肠癌组患者进行随访观察，平均随访时间为12个月。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。所有患者签订知情同意书，该临床试验通过我院伦理委员会批准。

表1 两组患者年龄及性别比例比较Tab 1 Comparison between age and sex ratio between two groups

1.2 RNA提取及RT-PCR反应 对结肠癌组患者行RNA提取，采用RNA提取试剂盒、TaqMan RNA试剂盒检测COX-2蛋白和NF-κB的相对表达量。采用RNU6作为内参进行校正。对COX-2蛋白和 NF-κB的表达水平采用二步法检测，第一步通过茎环引物合成互补DNA，对10 ng RNA进行逆转采用的是RNA的逆转录系统，加入10 μl的逆转录缓冲液至PCR管，将总RNA浓度调整至2 ng/μl，在以上基础上加入5 μl的逆转录引物，并将反应体系冰上反应5 min，接着行梯度变性反应，时间温度递减;第二步Platinum SYBR Green qPCR反应体系，Taqman RNA的特异性引物与2×PCR Taqman Universal的混合液，通过逆转录体系进行反应，首先将5 μl cDNA加入RNA中，扩增至20 μl，递减的扩张40个循环:94℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、60 s，72℃、7 min之后，分析实验数据，按照PCR操作说明，采用荧光实时定量反应。应用计算公式计算:△Ct=CtCOX-2蛋白和NF-κB-CtRNU6计算出相对表达量。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料以例数(%)表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组间COX-2蛋白和NF-κB的相对表达量 结肠癌组COX-2蛋白和NF-κB mRNA表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05，见表2)。

表2 两组间COX-2蛋白和NF-κB的相对表达量(±s)Tab 2 The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB between two groups(±s)

表2 两组间COX-2蛋白和NF-κB的相对表达量(±s)Tab 2 The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB between two groups(±s)

分组 COX-2蛋白 NF-κB 0.82±0.31 0.72±0.26结肠癌组 1.12±0.56 1.10±0.29 t值 3.023 3.对照组0.026 0.021 652 P值

2.2 COX-2蛋白和NF-κB表达与结肠癌临床参数之间的关系 COX-2蛋白和NF-κB在结肠癌有无转移方面比较，差异有统计学意义(P＜0.05);但二者不同年龄比较，差异无统计学意义(P＞0.05，见表3)。

表3 COX-2蛋白和NF-κB表达与结肠癌临床参数之间的关系Tab 3 The relationship of the expressions of COX-2 protein and NF-κB with clinical parameters of colon cancer

2.3 COX-2蛋白和NF-κB之间的相关性 将COX-2蛋白水平分为升高、正常，对NF-κB水平进行检测，COX-2蛋白正常者，NF-κB 水平为(0.69 ±0.17)pg/ml，COX-2蛋白升高者，NF-κB 水平为(1.73 ±0.34)pg/ml，COX-2蛋白升高，NF-κB水平也随之升高，COX-2蛋白与 NF-κB 呈正相关(r=0.626，P=0.001)。

3 讨论

结肠癌位于全世界癌症发病率排行的第三位，也是我国常见的消化道恶性肿瘤之一。多年来该病的发病率保持逐年上升的趋势。其中该病的复发和转移是影响患者预后及治疗效果的关键因素［4-6］。近年来，随着分子生物学技术的不断进步与发展，结肠癌的复发转移相关的生物学模式与分子遗传学特性逐步被发现和了解。虽然广大医学和科研工作者进行了充分且细致的研究，但是目前对于结肠癌的转移和复发，仍缺乏有效且可靠的方法检测及预测疾病的转归［7-9］。对于结肠癌相关的基因表达的研究，不仅对临床上结肠癌的分子生物学分型、早期诊断、复发及转移的早期检测，还可以阐明结肠癌的发生、发展、转移及复发的机制，且对治疗评估有着重要的意义［10］，而对于转移复发的结肠癌，发现并阐明其分子表面标志物的表达模式，对复发及转移性结肠癌的靶向分子治疗也具有重要的应用价值［11］。因此，寻找生物学靶标对于疾病的诊治至关重要。本研究为探求该病的侵袭机制，寻找靶点基因与疾病的相关性，对该病的治疗和预后判断提供一定的指导价值。

NF-κB是一种重要的核转录因子，在干扰素信号传导通路的研究中被发现［12］。NF-κB可以在细胞受到外界信号刺激下激活，不同的刺激信号可通过不同的上游途径诱导并直接入核，激活相应的靶基因转录。作为一种多向性核转录调节因子，其DNA结合域可识别的DNA序列碱基数较短，因此可以激活多个靶基因的表达。已有大量研究证明，NF-κB参与调控肿瘤细胞的发生、发展、分化及凋亡相关的细胞因子、功能性基因的表达。NF-κB在肺癌、肝细胞癌和乳腺癌等恶性肿瘤细胞中均存在异常表达。对该基因下游的信号通路也产生一定的影响，对肿瘤的发生、发展与转移也发挥着重要的作用。NF-κB在结肠癌中的表达已有文献报道。然而其在结肠癌细胞中起到的作用尚未完全阐明［13］。

COX-2蛋白是一类分子表面标志物。已有研究［13］证明，COX-2蛋白在乳癌、肝癌及白血病细胞等多种肿瘤细胞表面表达。在免疫细胞中，可以特异性地与细胞因子MIF结合，激活胞内ERK1/2的磷酸化。既往有研究证实，COX-2蛋白共刺激信号可能与NF-κB存在循环正反馈的双向调控机制;COX-2蛋白与NF-κB的表达存在一定的相关性。COX-2蛋白还可上调血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤血管生成间接刺激肿瘤生长和转移［14］。因此，COX-2蛋白对肿瘤的发生和发展是多方面、多层次影响的，其主要通过自身分泌、相关受体、胞内相关因子等环节影响肿瘤细胞的迁移和黏附及凋亡和分化能力，进而影响肿瘤的发生、发展、侵袭和转移。但是其具体调控机制及信号传导尚不明确。研究［15］发现，COX-2蛋白在肿瘤发生、发展过程中起着重要的调控作用。而NF-κB和COX-2蛋白之间是否存在相互作用可以有助于更好地了解结肠癌发生、发展的过程，因此，本研究探讨两者相互作用及相关性，希望能进一步了解结肠癌的发病机制。

通常细胞发生病变转化会造成相关基因的表型及其相关分子的相应变化，这些变化可能成为细胞程序性恶化的诱因，且与正常细胞的生长特征不同，因此可为我们寻找新的结肠癌作用靶点及标志物提供一定线索。在对COX-2蛋白和NF-κB的研究基础上，我们通过深入探讨COX-2蛋白和NF-κB作为诊断(早期诊断)、病情监测生物标记物的可能性;研究COX-2蛋白和NF-κB共表达的状况和消长关系，发现两指标之间具有互补应用的可能性。本研究结果显示，结肠癌组COX-2蛋白和NF-κB mRNA的表达值均显著高于健康志愿者;COX-2蛋白和NF-κB在结肠癌转移方面差异具有统计学意义;COX-2蛋白与NF-κB呈正相关。研究结果为结肠癌的早期防治提供新的思路和药物作用靶标，但更深入的分子机制值得进一步探讨。

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(责任编辑:王全楚)

Expressions of cyclooxygenase-2 protein and nuclear factor-kappa B in colon cancer and their correlation

WEN Guohua1，LI Yanling2，CHEN Qianya2
1.Department of Oncology;2.Department of General Surgery，Zengcheng District People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 511300，China

ObjectiveTo investigate the expressions of cyclooxygenase-2(COX-2)protein and nuclear factor-kappa B(NF-κB)in colon cancer and their correlation.MethodsForty-eight cases of colon cancer patients were included in Zengcheng District People’s Hospital，at the same time，30 healthy volunteers were selected as control group.The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR).And the relationship between colorectal cancer and their expressions was also summarized.ResultsThe relative expressions of COX-2 protein and NF-κB in colorectal carcinoma group were significantly higher than those in control group(P ＜0.05).The differences of COX-2 protein and NF-κB in the metastasis of colon cancer were statistically significant(P ＜0.05).NF-κB was positively correlated with COX-2.ConclusionThe expression of COX-2 protein in colorectal cancer is correlated with the expression of NF-κB.The relative expressions of COX-2 protein and NF-κB can be used as one of the predictive criteria for the metastasis of colon cancer.

Cyclooxygenase-2 protein;Nuclear factor-κB;Relative expression;Colon cancer

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0879-03

2017-03-27

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.010

温国华，本科，住院医师，研究方向:肿瘤相关治疗。E-mail:wenguoh1229@163.com