重楼皂苷I对结肠癌耐奥沙利铂细胞株的毒性研究

庞晓辉，王朝杰，崔勇霞，高天慧

河南省人民医院郑州大学人民医院肿瘤科，河南郑州450000

重楼皂苷I对结肠癌耐奥沙利铂细胞株的毒性研究

庞晓辉，王朝杰，崔勇霞，高天慧

河南省人民医院郑州大学人民医院肿瘤科，河南郑州450000

目的 探讨重楼皂苷Ⅰ对结肠癌耐奥沙利铂细胞的体外毒性及其机制。方法 复苏结肠癌SW480、LoVo细胞，采用大剂量冲击法诱导结肠癌耐奥沙利铂细胞，CCK-8实验检测其耐药性，Transwell细胞侵袭实验检测其侵袭性以鉴定其恶性生物学行为。CCK-8实验检测重楼皂苷Ⅰ对耐药细胞及其亲代细胞的毒性作用，Annexin V/PI染色流式细胞术检测重楼皂苷Ⅰ处理细胞后Annexin V/PI阳性细胞比例以检测其对细胞凋亡的作用。提取细胞总蛋白，Western blotting检测重楼皂苷I处理细胞后细胞中凋亡相关蛋白Bax和Caspass-3等蛋白的表达。结果 大剂量奥沙利铂冲击法成功诱导奥沙利铂耐药细胞LoVo/L-OHP、SW480/LOHP。CCK-8细胞毒性实验显示，LoVo/L-OHP、SW480/L-OHP的IC50值比其亲代细胞提高5～25倍，Transwell细胞侵袭实验证实，耐药细胞比亲代细胞具有更强的侵袭性(P＜0.019)。CCK-8实验显示，重楼皂苷I对SW480、LoVo及其耐奥沙利铂细胞的IC50值相似。Annexin V/PI染色、流式细胞仪检测凋亡细胞比例显示，重楼皂苷I处理细胞后，Annexin V/PI阳性细胞率明显升高，Western blotting结果显示，重楼皂苷Ⅰ处理细胞后细胞中Bax和Caspass-3蛋白表达水平升高。这两个实验证实，重楼皂苷Ⅰ能够促进结肠癌细胞及其耐药细胞凋亡。结论 重楼皂苷I对结肠癌细胞及耐奥沙利铂细胞均有良好的抗肿瘤活性，其抗肿瘤作用是通过介导结肠癌细胞凋亡实现的。

结肠癌;重楼皂苷I;奥沙利铂

结直肠癌(colorectal cancer)在全世界乃至中国都是发病率较高的恶性肿瘤之一，占胃肠道恶性肿瘤的第1位［1］，大部分患者需要化疗，FOLFOX和FOLFIRI系列方案被证实对结直肠癌的一线治疗方案。研究［2］证实这些化疗方案对晚期结肠癌患者一线治疗有效率均在50%左右。而二线化疗的有效率仅有10%左右甚至更低。因而寻找能够克服结肠癌耐药的化疗药物具有重要的临床意义和科研价值。

植物类抗肿瘤药物是抗肿瘤药物研发方向之一，重楼又名七叶一枝花，为延龄草科重楼属植物华重楼滇重楼的干燥根茎［3-4］。药理实验表明，重楼具有抗调节免疫、抑菌及镇痛和镇静等多种生理活性［5-6］。重楼皂苷抗肿瘤的作用机理在于其能够介导肿瘤细胞变性坏死［7］和凋亡［8-9］，也有研究［10］认为其能够通过抑制细胞DNA和蛋白质的生物合成来达到抗肿瘤的作用。基因组学研究［11-12］显示，重楼皂苷介导肿瘤细胞凋亡是通过线粒体和内质网实现的。

总之，耐药性是结肠癌临床治疗中经常遇到的问题［13］，而重楼皂苷具有良好的抗肿瘤作用。根据文献报道及本课题组之前的研究结果［14］，本研究组建立研究假设:重楼皂苷Ⅰ能够克服耐奥沙利铂结肠癌细胞株耐受性。为了证实研究假设，本研究将采用大剂量冲击法诱导耐奥沙利铂结肠癌细胞株，检测重楼皂苷Ⅰ对结肠癌耐奥沙利铂细胞的作用浓度，采用流式细胞术和Westernb blotting检测其对细胞的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 重楼皂苷Ⅰ购自上海恪敏生物科技有限公司，经HPLC鉴定，纯度均为97%。人结肠癌SW480、LoVo细胞由河南省人民医院中心实验室所保存。SW480、LoVo细胞耐药细胞株由本实验室所诱导。Hyclone澳大利亚新生胎牛血清购自郑州四季生物技术有限公司;RPMI 1640、DMEM干粉培养基购自GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亚砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)购自美国Sigma公司;CCK-8购自日本同仁化学研究所。Hanging Cell Culture Inserts、Matrigel胶均购自BD Biosciences公司，奥沙利铂购自山东齐鲁制药有限公司，AnnexinV-PI试剂购自Takara公司。实验所用酶标仪购自Bio-rad公司。流式细胞仪购自贝克曼公司。

1.2 实验步骤

1.2.1 细胞复苏与培养:将冻存管取出，立即放入38～40℃温水中不断摇晃，使冰冻的细胞液在30 s内解冻，移入无菌离心管，SW480、LoVo细胞中分别加入含100 g/L胎牛血清的DMEM和1640高糖培养液10 ml轻轻吹打成悬液，1 000 r/min离心5 min，吸弃上清液，加入含100 g/L胎牛血清1640或DMEM高糖培养液4 ml，轻轻吹打成悬液，种入75 ml培养瓶，置于37℃含体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱培养，次日可见细胞贴壁生长，换液。3～5 d长满瓶底80%，用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。传代后每2～3 d换液1次，取对数生长期细胞为实验对象。

1.2.2 SW480、LoVo、Colo320耐奥沙利铂细胞株的耐药诱导与维持:上述细胞传代后细胞生长至70%瓶底密度，根据前期实验的结肠癌细胞奥沙利铂IC50值、药代动力学及细胞加药处理后的反应，确定加3 mg/L奥沙利铂处理细胞并继续培养48 h。加药处理约48 h后更换培养基，继续培养至80%瓶底密度时进行上述的细胞传代，培养至80%细胞密度时继续按前浓度加药处理，一共加药6次。实验组加药结束脱药1个月后进行后续实验，对照组细胞同步进行传代培养。

1.2.3 CCK-8实验:本实验设阴性对照组、奥沙利铂组及重楼组。实验时，96孔板每孔取5×103的细胞，37℃培养24 h，待其贴壁进入对数生长期后更换培养基，奥沙利铂组加入含奥沙利铂的培养基，使其终浓度达到 0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;重楼组分别加含重楼提取物Ⅰ的培养基，使其终浓度达到0.1、0.5、1、2、4、8、16 mg/L;阴性对照组加入与实验组相同浓度的DMSO。以上细胞加药培养48 h后换100 μl无血清培养基并加入10 μl CCK-8，孵箱孵育2 h后放入酶标仪进行测定。检测450 nm处的吸光值，630 mm吸光值作为参照。该实验重复3次。

1.2.4 Transwell细胞侵袭实验:用含100 g/L胎牛血清的DMEM或RPMI 1640培养液常规培养细胞，在细胞长势良好的情况下换无血清培养液继续培养24 h，然后收集培养上清液，过滤除菌，冰冻保存备用;Matrigel胶与无血清RPMI 1640培养液按1∶2.5比例稀释凝胶，冰浴稀释液并逐一包被Transwell小室底部，将小室放入24孔培养板中，置于培养箱，待胶凝后即可用;在小室外加入1 ml按1∶1混合的条件培养液和完全培养液，在小室内加入400 μl细胞悬液，细胞数为1×104，培养液为含10 g/L BSA和10 g/L胎牛血清的RPMI 1640培养液。每组重复4个样本;细胞常规培养48 h;取出Transwell小室，PBS清洗，用棉签轻轻擦去微孔膜上层的细胞，950 ml/L酒精固定，苏木素染色。细胞数量不多时计数全视野穿膜的细胞，数量多时随机挑取10个视野计数。相对侵袭指数(relative invasion index)的计算公式:N2/N1×100%，其中N2代表耐药细胞的穿膜数，N1代表对照细胞的穿膜数。

1.2.5 Western blotting实验:本实验设置实验组和对照组，1×106细胞/75 mm培养皿培养24 h，待其贴壁生长进入对数生长期后，实验组加0.8 mg/L的重楼皂苷Ⅰ，对照组加入相同浓度的DMSO。37℃培养24 h、48 h后，收集对数生长期细胞，用50～100 μl三去污裂解液重悬细胞，反复吹打3～5 min。混匀后于4℃温育20 min，12 000×g离心20 min后取上清检测细胞总蛋白，紫外分光光度法检测蛋白含量，按比例加入加样缓冲液。取蛋白样品12 μg，进行120 g/L SDS-PAGE，湿转至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭2 h，加入10 g/L脱脂奶粉稀释的抗 Bax、Caspass-3、β-actin 的抗体(1∶1 000)4℃过夜，PBS洗涤3次，加入二抗(1∶2 000)，室温轻摇2 h，最后用红外荧光扫描成像系统显色。

1.2.6 Annexin V/PI染色、流式细胞仪检测AnnexinV/PI阳性细胞比例:本实验设立实验组和对照组，实验时，取6孔板，每孔加入5×105的细胞培养24 h，待其贴壁并进入对数生长期后，实验组加1 mg/L的重楼皂苷Ⅰ，对照组加相同浓度的DMSO。在37℃，体积分数为5%的CO2饱和湿度孵箱培养24 h后，收集培养基和细胞:悬浮细胞直接收集到离心管中，而贴壁细胞消化使之脱壁，500～1 000 r/min离心5 min弃去培养液。用孵育缓冲液洗1次，500～1 000 r/min离心5 min。再用孵育缓冲液洗1次，500～1 000 r/min离心5 min，用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。500～1 000 r/min离心5 min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。加入荧光溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动，上机检测。

2 结果

2.1 奥沙利铂诱导出对奥沙利铂耐药的结肠癌细胞为了研究重楼皂苷Ⅰ对结肠癌细胞及结肠癌耐奥沙利铂细胞的毒性作用，我们根据药物代谢动力学，诱导本实验所需的耐药细胞。最终确定诱导的奥沙利铂浓度为1 mg/L。选用LoVo、SW480细胞。初次加药后24 h细胞死亡率达80%，待细胞长至约70%平底面积时传代培养，如此反复加药处理8次，最后一次加药后培养24 h细胞死亡率为20%。脱药培养1个月后检测细胞对奥沙利铂耐药性。LoVo细胞和SW480细胞的IC50值分别为2.713 mg/L和4.987 mg/L。耐药性分别提高了24倍和7倍(见表1)。

表1 重楼皂苷Ⅰ及奥沙利铂对结肠癌细胞的IC50值(±s，mg/L)Tab 1 PolyphyllinⅠand oxaliplatin on colon cancer cells IC50(±s，mg/L)

表1 重楼皂苷Ⅰ及奥沙利铂对结肠癌细胞的IC50值(±s，mg/L)Tab 1 PolyphyllinⅠand oxaliplatin on colon cancer cells IC50(±s，mg/L)

组别 重楼皂苷Ⅰ 奥沙利铂LoVo 0.419±0.028 0.113±0.021 LoVo/L-OHP 0.801±0.107 2.713±0.110 SW480 0.404±0.113 0.670±0.051 SW480/L-OHP 1.095±0.205 4.987±0.127

2.2 耐药细胞具有更强的侵袭性 我们采用Transwell细胞侵袭实验检测其侵袭性。结果显示，SW480/L-OHP穿膜细胞数明显高于SW480细胞，差异具有统计学意义(P＜0.019，见图1)。相对侵袭指数为1.84。奥沙利铂耐药细胞株比亲代细胞具有更强的侵袭性，具有较强的恶性生物学行为(见图1)。

2.3 重楼皂苷Ⅰ对耐奥沙利铂结肠癌细胞表现出良好的抗肿瘤活性 CCK-8检测重楼皂苷Ⅰ对SW480细胞及其奥沙利铂耐药细胞的毒性。采用梯度浓度的重楼皂苷Ⅰ处理细胞48 h，CCK-8检测凋亡细胞比例。结果显示，重楼皂苷Ⅰ对SW480细胞及其耐药细胞的IC50值相近。重楼皂苷Ⅰ对亲代细胞和耐药细胞具有相同的抗肿肿瘤活性(见表1)。

图1 耐药细胞具有更强的侵袭性 A:LoVo;B:LoVo/L-OHPFig 1 Resistant cells were more aggressive A:LoVo;B:Lo-Vo/L-OHP

2.4 流式细胞术及Western blotting实验证实重楼皂苷Ⅰ对结肠癌细胞的毒性是通过介导肿瘤细胞凋亡实现 与对照组相比，加药培养的细胞中AnnexinV/PI双染色及AnnexinV染色阳性细胞比例明显增加。重楼皂苷Ⅰ能够介导肿瘤细胞凋亡(见图2)。为了进一步验证重楼皂苷Ⅰ能够介导肿瘤细胞凋亡。Western blotting检测结果显示:加药处理的细胞Bax、Caspass-3蛋白表达升高。重楼皂苷Ⅰ能够促进结肠癌细胞凋亡，进而发挥其抗肿瘤特性(见图3)。

图2 重楼皂苷Ⅰ诱导LoVo及其耐药细胞凋亡 A:LoVo;B:重楼皂苷Ⅰ处理后的LoVo;C:LoVo/L-OHP;D:重楼皂苷Ⅰ处理后的LoVo/L-OHPFig 2 LoVo induced by Polyphyllin I and its resistance to apoptosis A:LoVo;B:LoVo after treatment of Polyphyllins I;C:LoVo/L-OHP;D:LoVo/L-OHP after treatment of PolyphyllinsⅠ

图3 重楼皂苷Ⅰ能促进LoVo及其耐药细胞Caspass-3和Bax蛋白不表达，促进细胞凋亡Fig 3 Polyphyllins I could promote expressions of Caspass-3 and Bax protein in LoVo cell and resistant cells，promote cell apoptosis

3 讨论

临床上，结直肠癌化疗行之有效的药物为氟尿嘧啶、奥沙利铂、伊立替康等药物。研究显示，一线化疗对50%以上的结直肠癌患者有效，二线化疗的有效率则不到10%。因此，寻找对耐药患者有效的药物有着重要的临床意义和科研价值。

重楼皂苷Ⅰ为重楼的提取物，具有良好的抗肿瘤作用，能够介导肿瘤细胞凋亡，对肝癌、肝癌、卵巢癌等细胞株均具有良好的抗肿瘤作用。本课题组前期研究发现，重楼皂苷Ⅰ对4个结肠癌细胞株均具有良好的抗肿瘤作用。本研究为了深入研究其对结肠癌细胞的作用及其对结肠癌耐药细胞株的作用，采用大剂量冲击法诱导结肠癌耐奥沙利铂细胞，CCK-8研究其对结肠癌耐药细胞株的作用浓度，流式细胞术和Western blotting检测其作用机制。研究结果显示，重楼皂苷Ⅰ对结肠癌细胞及其耐药细胞具有相近的作用浓度，AnnexinV/PI染色、流式细胞仪检测细胞检测阳性细胞显示，重楼皂苷Ⅰ处理后，AnnexinV/PI阳性细胞比例明显升高。Western blotting显示，重楼皂苷Ⅰ能够上调Bax、Caspass3蛋白表达，从而介导肿瘤细胞凋亡。本研究结果具有重要的临床意义，为逆转结肠癌耐药提供了一个新的研究方向，为重楼皂苷Ⅰ的临床应用打下了基础。然而本研究也有其局限性，例如:本研究未进行深入的机制研究，不能具体阐释重楼皂苷Ⅰ是否是通过蛋白、DNA、酶体等机制介导肿瘤细胞凋亡，缺乏相应的动物实验及临床研究。本课题组将继续本项研究，为结肠癌药物的研发指出一个新的方向。

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(责任编辑:马 军)

Study on toxicity of PolyphyllinⅠon colon cancer cell lines resistant to oxaliplatin

PANG Xiaohui，WANG Chaojie，CUI Yongxia，GAO Tianhui
Department of Oncology，Henan Provincial People’s Hospital，People’s Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China

ObjectiveTo investigate the anticancer activity of PolyphyllinⅠ on colon cancer cell lines resistant to oxaliplatin.MethodsPolyphyllinⅠwas isolated from the rhizome of Sichuan polyphylla.The oxaliplation resistant cells(SW480/L-OHP，LoVo/L-OHP)were established by continuously exposing to high-dose concentration of oxaliplatin(L-OHP).The oxaliplation resistant cells and their parental cells were cultured and then treated with stepwise concentrations(0.1，0.5，1，2，4，8 mg/L)of Polyphyllin I for 48 hours，respectively.The inhibiting rates of SW480，LoVo cells by Polyphyllin I were determined by CCK-8 assay.Transwell migration assays was used to assess cell invasion viability.Cells were stained with Annexin V/PI in the detection of apoptosis by flow cytometry.Total protein was extracted and Western blotting was used to detect the expressions of Bax and Caspass-3 after cultured with Polyphyllin I for 24 hours.ResultsLoVo-OHP，SW480/L-OHP were induced successfully by large dose of oxaliplatin method.CCK-8 cytotoxicity tests showed that IC50values of LoVo-OHP and SW480/L-OHP were increased by 5-25 times than those of their parental cells.The proportion of Annexin V/PI positive cells elevated after treated with PolyphyllinⅠ.PolyphyllinⅠup-regulated expressions of Bax and Caspass-3 PolyphylinesⅠcould promote the apoptosis of colon cancer and resistant cells.ConclusionPolyphyllin I shows anticancer activity against oxaliplatin resistant colon cancer cell in vitro.

Colon cancer;Polyphyllin I;Oxaliplatin

R735.3+5

A

1006-5709(2017)08-0865-04

2017-06-05

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.08.007

庞晓辉，主治医师，博士，研究方向:恶性肿瘤的临床诊治。E-mail:pangxh0321@163.com

高天慧，主任医师，博士，研究方向:恶性肿瘤的临床诊治。E-mail:gaotianhui123456@163.com