大黄素对脑出血大鼠血肿周围脑组织含水量、肿瘤坏死因子-α和谷氨酸表达水平的影响*

彭绍鹏，刘建雄，崔庆荣，周东春，周 广，王 超

(1.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中医药管理局，甘肃 兰州 730000;3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

·实验研究·

大黄素对脑出血大鼠血肿周围脑组织含水量、肿瘤坏死因子-α和谷氨酸表达水平的影响*

彭绍鹏1，刘建雄1，崔庆荣2，周东春1，周 广3，王 超3

(1.甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000； 2.甘肃省中医药管理局，甘肃 兰州 730000;3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

目的：探讨大黄素对脑出血大鼠血肿周围脑组织含水量、肿瘤坏死因子-α和谷氨酸表达水平的影响及其治疗脑水肿的可能机制。方法：取自体股动脉血约100 μL，注入大鼠纹状体区域，采用随机分组法分为大黄素治疗组、假手术组和模型对照组3组，每组30只。假手术组和模型对照组以生理盐水灌胃，每次给药剂量为6 μL /g体质量，1 d 2次；大黄素治疗组在造模成功后以6 g/L大黄素混悬液灌胃，给药剂量为100 μg/g体质量，1 d 1次。术后通过大鼠改良Bederson评分进行行为学评定，干湿重法测脑组织含水量，双抗体夹心ELISA法检测脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，免疫组化法检测脑组织中谷氨酸(glutamate，Glu)表达。结果：模型对照组的改良Bederson评分明显高于同时间点的假手术组(P<0.05)；各时间点的大黄素治疗组的改良Bederson评分均低于同时间点的模型对照组(P<0.05)。模型对照组血肿周围脑组织含水量、TNF-α和Glu与同时间点的假手术组对比，差别均有统计学意义(P<0.05)；造模后第5天脑组织含水量、TNF-α和Glu表达均达最高值，3个指标之间呈正相关性。大黄素治疗组血肿周围脑组织含水量、TNF-α和Glu较同时间点的模型对照组均降低，差别均有统计学意义(P<0.05)，且3个指标在第5天均达最高值，3者之间呈正相关性。结论：脑出血大鼠出现明显的脑水肿和神经功能损伤，且出血后TNF-α和Glu在第5天达到最高值，可能的生物学效应机制是大黄素抑制炎性因子的释放、降低谷氨酸的表达水平。

大黄素/作用；脑出血；脑水肿；肿瘤坏死因子-α；谷氨酸；动物；大鼠

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是脑血管病中发病急、病情严重、致残率和致死率非常高的非外伤性脑实质内出血性疾病[1-2]。病理学研究[3-4]发现：出血后血肿周围脑组织因脑血流改变、脑组织水肿、炎症刺激和细胞凋亡等很容易引起氨基酸的释放，最终导致抑制性和兴奋性氨基酸平衡失调。研究[5]发现：炎性因子可导致脑出血后脑水肿和继发性神经损伤。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)属于前炎性细胞因子，在诱导炎症反应过程中起重要作用[6]；谷氨酸(glutamate，Glu) 是凝血酶受体重要的激动剂，在脑细胞的能量代谢中具有加速代谢障碍、诱导细胞凋亡的作用[7]。本研究采用自体血脑内注射法制备脑出血大鼠模型，予以大黄素干预，检测了不同时间点血肿周围脑组织含水量、TNF-α及谷氨酸的表达水平。

1 材料与方法

本实验采用随机对照动物实验，于2016年1月—2016年6月在甘肃中医药大学科研实验中心完成。饲养温度控制在20～25 ℃，光照充足，自由饮食、饮水，所有的实验动物操作程序符合《实验动物管理和使用指南》规定，并经甘肃中医药大学医学伦理委员会批准。

1.1 动 物

SPF级6周龄SD大鼠90只，体质量(200±20) g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研实验动物中心提供，批号SYXK(甘)2015-0001-62001000000038。

1.2 药品、试剂与仪器

大黄素标准品, 20 mg/支，中国药品生物制品检定所提供，批号110756。称取大黄素0.6 g，加90 mL 双蒸馏水、10 mL吐温-80，配置成质量分数6 g/L 的大黄素混悬液，无菌玻璃瓶盛装，封口膜封闭瓶口，置4 ℃冰箱备用，使用前复温至37 ℃且摇匀。小鼠抗大鼠AQP4单克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品，批号20100364；改进型柠檬酸钠抗原修复液(50×)，上海碧云天公司产品，批号20151026；SAP法检测试剂盒，北京中杉金桥公司产品，批号20160325；BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒，上海碧云天公司产品，批号20151018；RT-PCR试剂盒，武汉博士德公司产品，批号20100364。FA 1104型电子分析天平，上海天平仪器厂产品；动物缺氧活动箱，深圳瑞沃德公司产品，批号20151112；BM-E型生物研究显微镜，德国Leica公司产品；Olypums-45型显微生物照相显微镜，日本Olypums公司产品；ND-1000型紫外分光光度计，美国Thermo公司产品；C1000型普通PCR仪、CFX-96型实时定量PCR仪，均为美国BIO-RAD公司产品。

1.3 自体脑出血模型的建立

采用自体血脑内注射法。参照王哲等[8]设计的自体脑出血模型造模方法，具体方法如下：以水合氯醛(100 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠；固定于脑立体定位仪上；常规消毒后取中位线位置切开大鼠头皮，去骨膜，暴露前囟，压迫止血；用高速牙科颅钻在颅骨上钻孔(直径约2 mm)至硬脑膜，可见坐标为前囟前0.2 mm、旁开3.5 mm、深5.5 mm，即大鼠纹状体区域；使用胰岛素针取股动脉血约100 μL，立即缓慢匀速(20 μL/min)注射至大鼠纹状体区域；注射完毕停留20 min，缓慢拔出胰岛素针头；骨蜡封闭骨孔；消毒并缝合切口。

1.4 动物分组与给药

将动物随机分为大黄素治疗组、假手术组和模型对照组3组，每组30只。所有的大鼠在脑立体定位后6 h进行首次灌胃，其后按设计频率灌胃直至脑立体定位后7 d时给药结束。假手术组和模型对照组以生理盐水灌胃，每次给药剂量为6 μL /g体质量，1 d 2次；大黄素治疗组在造模成功后以6 g/L大黄素混悬液灌胃，1 d 1次，给药剂量为100 μg/g体质量。

1.5 检测指标

选取出血后5个观察点，即造模成功后的第1，2，3，5，7 天，每个观察点观察6只大鼠。各组均进行行为学检测，检测后处死大鼠，取材，石蜡包埋或流式细胞术检测。

1.5.1 行为学评定

按照改良Bederson法[9]，在造模成功后的第1，2，3，5，7天分别观察大鼠的神经功能情况，并给出评分。该评分的高低与神经损伤程度的严重性呈正相关。0分：神经功能基本正常。0.5分：四肢均出现屈曲情况，提尾悬空实验(+)。1分：前肢存在屈曲。1.5分：仅一侧前肢存在屈曲。2分：侧向推力实验(+)，前肢可出现屈曲现象。2.5分：抵抗侧推能力下降，同时出现后肢屈曲现象，但大鼠转圈行为不出现。3分：除可以观察到的2分行为以外，还出现自发性旋转现象。

1.5.2 脑组织含水量

按照参考文献[10]测定方法，在相应的时间点常规处死大鼠，去除额极后取病变侧脑组织约2 mm厚，采用干湿重法测定脑出血灶周围脑组织含水量。①脑组织湿重测定： 将脑组织放入事先已称重的锡纸(A表示)中，然后立即称量其质量(B表示)，B-A即是脑组织湿重。②脑组织干重测定：将脑组织用A包裹，放入电烤箱内，温度100 ℃ 烘干 24 h后取出，待温度恢复到室温时称量质量(C表示)，C-A=干重。③脑组织含水量计算：脑组织含水量=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%，字母表示为：(B-C)/(B-A)×100%。

1.5.3 脑组织TNF-α含量

在术后不同时间点，以手术针眼为中心取厚约2 mm、质量约200 mg的脑组织；充分磨碎使脑组织浆化，制成400 g/L 组织匀浆；4 ℃ 4 000 r/min离心15 min后取上清液，采用双抗体夹心ELISA法检测脑组织TNF-α含量，严格根据试剂盒说明书进行。

1.5.4 脑组织Glu表达水平

以手术针眼为中心取厚约2 mm、质量约 200 mg 的脑组织，-70 ℃保存；将组织放入质量分数为40 g/L的多聚甲醛(pH 值7.4)固定液固定4 h；转入100，200，300 g/L 蔗糖PBS浸泡以防冰晶；用0.01 mol/L PBS稍作冲洗；在切片机里连续切成厚约10 μm的组织切片，甲苯胺蓝液显色定位。采用免疫组化法检测脑组织中Glu表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。采用阳性细胞计数法，每张切片在400倍物镜下分别选取血肿周围不重复的5个视野(HP)，计数Glu阳性细胞数，取平均值。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组大鼠改良Bederson评分对比

模型对照组改良Bederson评分明显高于同时间点的假手术组,差别有统计学意义(P<0.05)。各时间点的大黄素治疗组的改良Bederson评分均低于同时间点模型对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠改良Bederson评分对比 分,

注：与同时间点假手术组对比,*P<0.05；与同时间点模型对照组对比，#P<0.05。

2.2 各组大鼠脑组织含水量、TNF-α及Glu表达对比

模型对照组血肿周围脑组织含水量、TNF-α及Glu与同时间点的假手术组对比，差别均有统计学意义(P<0.05)；造模后第5天脑组织含水量、TNF-α和Glu表达均达到最高值，3个指标之间呈正相关性。大黄素治疗组血肿周围脑组织含水量、TNF-α和Glu较同时间点模型对照组均降低，差别均有统计学意义(P<0.05)，且3个指标在第5天均达最高值，3者之间呈正相关性。见表2。

级 别时间脑组织含水量/%TNF⁃α/(ng·L-1)Glu/(μmol·L-1)假手术组造模后第1天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第2天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第3天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第5天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68造模后第7天74．23±2．580．96±0．132．73±0．68模型对照组造模后第1天80．84±1．19∗8．64±1．36∗10．78±0．68∗造模后第2天83．42±1．01∗9．03±2．50∗22．93±1．79∗造模后第3天87．34±0．21∗9．80±2．53∗32．55±3．80∗造模后第5天91．62±1．08∗12．38±3．47∗37．28±4．20∗造模后第7天88．63±1．02∗10．57±2．80∗7．48±0．46∗大黄素治疗组造模后第1天77．91±1．16∗#5．34±1．01∗#7．87±1．12∗#造模后第2天79．95±1．02∗#5．96±1．04∗#17．58±2．83∗#造模后第3天82．87±1．04∗#6．22±1．55∗#24．64±2．68∗#造模后第5天86．50±1．01∗#7．78±1．85∗#26．08±3．13∗#造模后第7天84．31±1．02∗#3．26±0．58∗#5．26±0．84∗#

注：与同时间点假手术组对比，*P<0.05；与同时间点模型对照组对比,#P<0.05。

3 讨 论

脑出血严重危害人类的健康，流行病学研究[11]发现：我国每年新发病ICH患者约200万人，每年的发病患者约600万人，死亡率40%～60%，存活患者中伴有不同程度后遗症者约占80%，给患者家庭及社会造成巨大的经济负担和精神负担。研究[12]表明：脑出血时多伴有不同程度的脑水肿和炎性因子释放。TNF-α是前炎性细胞因子，可直接促进中性粒细胞向病灶区聚集，诱导受损细胞释放较多的炎性细胞因子，这与脑出血后周围脑组织水分含量呈正相关性[13]。Glu主要存在于中枢神经系统，是最强的神经兴奋性递质[14]。在机体正常情况下，Glu作用于突触后膜的特异性受体，完成兴奋性突触传递的生理性作用，常常与抑制性神经递质保持着动态平衡。研究[15]发现：Glu含量过高,组织间平衡性被打破，神经毒性释放过度，加重继发性脑损伤的程度。因此，探讨TNF-α和Glu表达水平在脑水肿的发病机制中有着重要意义。脑出血属中医学“出血性中风”范畴，病因较为复杂，属本虚标实之证。相关研究显示痰热腑实证占中风中医分型的74.17%，因此在治疗中给予通腑疗法是十分重要的[16]。近年来，大黄作为泻下药的代表性药物，在脑卒中治疗中的应用引起了国内外研究者的重视[17]，但大黄在ICH后病理生理过程中的作用机制并不明确；因此，探讨大黄素对脑出血后脑水肿及血肿周围TNF-α和Glu表达水平的影响，对揭示大黄治疗脑出血的机制有一定意义。《素问·生气通天论》曰：“阳气者，大怒则行气绝、而血菀于上，使人薄厥。”此充分说明了气血并走于上、逆乱犯脑是中风的基本病机。治以通降之法，给予大黄能起到釜底抽薪的作用，使浊气通降、气机疏通、气血下行，最终使神明复苏，气复返则生。大黄素主要存在蓼科植物大黄、虎杖、何首乌等的根茎中，是一种蒽醌类物质。目前，人们对大黄素认知的主要药理作用为抗肿瘤、免疫抑制、解痉止咳、利尿、降压、泻下等，其中脑中的血药浓度约为血中药物浓度的1/5[18]。

从本实验结果可以看出，TNF-α和Glu参与了ICH后脑水肿的形成，随着病情的变化、病程的进展，TNF-α呈动态发展，呈现先上升后下降的趋势，大黄素治疗组的TNF-α在第5天达最高值，此可提示大鼠ICH后脑水肿症状减轻，血肿的TNF-α随之降低，呈正相关性。其可能的机制是：TNF-α在ICH后诱导对其敏感的细胞发生细胞毒性作用，加速细胞凋亡并诱导细胞毒性脑水肿的出现和自由基形成。ICH后脑内血肿压迫局域组织造成局部组织的缺血性再灌注，产生大量的超氧阴离子和炎性反应，激活病灶区的多形白细胞产生大量氧自由基，自由基导致脑组织微血管内皮细胞坏死，引起脑血管通透性增加，进一步加重脑水肿，形成脑组织损伤的恶性循环。从本实验结果可以看出，大黄素干预组大鼠血肿周围Glu含量变化与模型对照组对比差别有统计学意义(P<0.05)，与脑组织含水量变化一致，因此，可推断大黄素通过抑制脑出血血肿周围组织中Glu的含量来减轻脑出血后脑水肿程度。

综上所述，TNF-α和Glu在ICH患者的血清中呈高表达，两者的异常增高提示ICH后血肿的严重程度，提示血清中TNF-α和Glu的表达可以作为预测ICH脑水肿病情轻重的重要客观指标。采用大黄素治疗ICH，在缩短血肿吸收时间、减轻脑出血后脑水肿方面作用明确，可能的机制是大黄素抑制TNF-α和Glu的表达。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)08-0063-05

R743.34

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.08.28

刘建雄，教授，主任医师，医学博士，ljx-512@163.com

甘肃省中医药管理局立项课题(GZK-2016-7)

2016-11-21；

2017-07-03