莱克多巴胺新型分子印迹纳米管膜的研究及应用

陈 忻, 陈晓刚, 潘嘉慧,沈国权, 赵亮亮, 梁 勇

(1. 佛山科学技术学院, 佛山 5282311; 2. 佛山市质量计量监督检测中心, 佛山 528225; 3. 华南师范大学化学与环境学院, 广州 510006)

莱克多巴胺新型分子印迹纳米管膜的研究及应用

陈 忻1, 陈晓刚1, 潘嘉慧2,沈国权2, 赵亮亮2, 梁 勇3*

(1. 佛山科学技术学院, 佛山 5282311; 2. 佛山市质量计量监督检测中心, 佛山 528225; 3. 华南师范大学化学与环境学院, 广州 510006)

基于表面引发原子转移自由基聚合 (ATRP), 采用阳极氧化铝 (AAO) 膜合成了莱克多巴胺印迹聚合物(MIP)纳米管膜, 以甲基丙烯酸(MAA)作为功能单体,n(莱克多巴胺)∶n(MAA)为1∶6. 利用扫描电子显微镜 (SEM) 对MIP纳米管膜的形态进行表征, 结果显示, 在AAO表面成功修饰了MIP纳米管膜. 与莱克多巴胺NIP纳米管膜相比, MIP纳米管膜对莱克多巴胺及其类似物有更高的吸附容量和更好的选择性. 建立了MIP纳米管膜萃取与HPLC联用, 针对β2-肾上腺素受体激动剂检测的方法. 莱克多巴胺(RAC)的线性范围是10～1 000 μg/L, 克伦特罗(CLEN)、肾上腺素(EP)和多巴胺(DA)的线性范围为100～1 000 μg/L, 特布他林(TER)的线性范围是200～1 000 μg/L. 检出限的范围在0.74～2.50 μg/L. 该方法能对猪肉样品中β2-肾上腺素受体激动剂实现有效检测.

分子印迹聚合物; 阳极氧化铝膜; 原子转移自由基聚合;β2-肾上腺素受体激动剂

莱克多巴胺 (Ractopamine, RAC) 属于β2-肾上腺素受体激动剂类药物, 能促进动物肌肉生长和蛋白质堆积, 但是, 过量使用会导致其在动物组织中累积, 可能影响人类健康. 因此, 对样品中RAC的残留进行检测显得尤为重要[1]. 目前用于莱克多巴胺的检测方法有气相色谱法[2]、高效液相色谱法 (HPLC)[3]、气相色谱-质谱联用法[4]、液相色谱-质谱联用法[5-6]、分子印迹聚合物萃取-液相色谱联用[7-8]和分子印迹聚合物电化学传感器[9-10]等. 无论采取何种分析方法, 为了降低检出限和消除干扰, 通常需要富集和洗脱等步骤.

分子印迹技术是能够设计和构建对目标分子实现特异性识别的三维空穴的体系[11]. 多数研究将莱克多巴胺印迹聚合物(MIP)用作吸附剂[7-12]. 虽然这些方法操作简便, 且能选择性地提取β2-肾上腺素受体激动剂, 但是吸附量并不高. 因此, 建立一种对于监测β2-肾上腺素受体激动剂的简便、高效、高选择性、稳定的预处理方法显得尤为重要.

阳极氧化铝 (AAO) 膜是一种表面积极大的二维纳米点阵材料, 并且有良好的吸附性能[13]. 由于拥有高度有序六边形纳米孔序列, 以及孔径、厚度、形状可调的优点, AAO可用于制造各种各样纳米结构的材料, 比如纳米点、纳米棒、纳米线、纳米管、纳米孔阵列[14-20]. 利用AAO作为分子印迹的纳米反应器可以有效克服传统印迹存在的问题. 六边形的AAO通道可以固化单体和模板分子的纳米反应器. 制得的AAO-MIP尺寸小, 具有极高的比表面积, 因此, 大多数的模板分子位于MIP的表面或表面附近, 并有望提高结合能力、改善结合动力学, 以及增加模板进入识别位点的机会[21].

本文利用表面引发原子转移自由基聚合在多孔氧化铝阳极氧化膜上合成了莱克多巴胺MIP纳米管膜. 原子转移自由基聚合 (ATRP) 是基于卤素原子从引发剂转移到单体的, 随后的聚合物链增长是由调节转移的过渡金属复合物催化发生的. 作为活性可控自由基聚合的一种, ATRP可应用在各种诸如硅胶、纳米管膜和酵母的印迹载体上的表面接枝印迹聚合[22-25]. 本研究建立了MIP纳米管膜萃取-高效液相色谱联用的检测方法, 并实现对复杂样品中β2-肾上腺素受体激动剂的检测.

1 实验部分

1.1 试剂

阳极氧化铝(AAO)板 (上海上木科技有限公司)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、无水乙醇、甲苯、二氯甲烷、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(97%, 阿拉丁试剂有限公司)、α-甲基丙烯酸 (MAA, 99%, 阿拉丁试剂有限公司)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTMOS, 阿拉丁试剂有限公司)、1,1,4,7,7-五甲基二乙烯基三胺 (PMDETA, 阿拉丁试剂有限公司)、2-溴代异丁酰溴 (BMBB, 阿拉丁试剂有限公司)、溴化亚铜 (阿拉丁试剂有限公司)、多巴胺 (DA, 阿拉丁试剂有限公司)、肾上腺素 (EP, 阿拉丁试剂有限公司)、特布他林 (TER, 阿拉丁试剂有限公司). 莱克多巴胺 (RAC) 和克伦特罗 (CLEN) 购自德国Ehrenstorfer GmbH实验用水为双蒸水, 且经滤膜(孔径0.45 μm)过滤器过滤.

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(LC-20ATVP, 日本岛津公司)、配有二极管阵列检测器、用于莱克多巴胺、克仑特罗、肾上腺素、特布他林、多巴胺的分析. 阳极氧化铝膜用带注射器式过滤器的蠕动泵洗脱. 扫描电子显微镜(S-4300, 日本株式会社日立制作所)用于研究MIP纳米管膜的形貌观察.

1.3 色谱条件

色谱柱: Venusil HILIC 色谱柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm); 流动相A: 0.1%(V/V)磷酸缓冲液; B: 甲醇; 流速: 0.6 mL/min; 梯度洗脱: 7 min内B的体积分数φB从20% 线性增加至67%, 随后维持4 min, 最后调节φB恢复至20%. 波长: 223 nm (莱克多巴胺), 243 nm (克仑特罗、肾上腺素、特布他林、多巴胺).

1.4 AAO膜的表面修饰

AAO膜的修饰采用文献[12]的方法. ATRP引发剂修饰的AAO膜的制备采用两步法. 第一步是在厚度为140 μm, 带有孔径为200 nm的氧化铝板修饰APTMOS. 在100 mL的圆底烧瓶中依次加入3 mL无水乙醇, 0.5 mL APTMOS, 待其充分混匀后再加入0.2 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH 5.0), 摇匀. 将多孔氧化铝膜浸入上述溶液中, 并将此圆底烧瓶抽真空10 min, 以保证氧化铝膜的纳米孔洞完全浸润在溶液中. 从溶液中取出氧化铝膜, 在100 ℃下真空加热反应2 h. 第二步是将大分子引发剂ATRP (2-溴代异丁酰溴) 接枝到硅烷化的AAO膜上, 作用于后续的分子印迹聚合物的聚合过程. 经充分干燥的三口烧瓶中加入4 mL无水二氯甲烷和160 μL无水三乙胺, 将经硅烷化的氧化铝膜浸入该溶液中, 氮气保护, 冰浴20 min. 在冰浴条件下, 不断摇荡, 将4 mL含100 μL 2-溴代异丁酰溴的无水二氯甲烷溶液缓慢地逐滴加入上述溶液体系中, 室温下反应12 h. 将反应后的氧化铝膜取出, 依次用二氯甲烷和丙酮清洗, 真空40 ℃下干燥备用.

1.5 AAO膜上莱克多巴胺MIP的制备

在AAO膜上利用原子转移自由基聚合的方法合成莱克多巴胺MIP (AAO@MIP)(图1). 由于莱克多巴胺在其他溶剂中溶解度较低, 因此聚合反应采用的溶剂为二甲基亚砜 (DMSO). 经过计算机软件模拟和实验条件优化, 功能单体以及交联剂分别选择MAA和EGDMA. 模板、功能单体和交联剂的最佳物质的量之比是1∶6∶30. 混合溶液在室温下搅拌2 h以形成印迹分子和功能单体复合体. 溶液经过通氮气20 min除氧, 然后加入4 μmol PMDETA和2 μmol金属有机催化剂CuBr, 将表面引发ATRP引发剂化的氧化铝膜浸入上述溶液中, 在氮气保护下70 ℃反应24 h. 将氧化铝膜取出, 分别用甲醇-乙酸(体积比9∶1)和甲醇作洗脱剂冲洗氧化铝膜的纳米孔洞, 最后将氧化铝膜60 ℃下真空干燥. 空白的AAO非印迹聚合物 (AAP@NIP) 的合成, 除了不加入模板莱克多巴胺之外，完全采用上述的方法合成.

图1 基于ATRP在AAO膜表面接枝MIP的示意图

Figure 1 Schematic of the grafting of MIP on AAO template via ATRP

1.6 吸附性能测试

为探究AAO@MIP纳米管膜的吸附效果, 对其进行动态和静态吸附实验. 将AAO@MIP纳米管膜置于循环洗脱系统中, 取10 mL不同浓度的莱克多巴胺甲醇试液, 在蠕动泵的作用下，在一定的时间内，在系统中对纳米管膜进行洗脱. MIP纳米管膜对莱克多巴胺的吸附量可以通过测定溶液中莱克多巴胺的剩余量测得. 吸附和竞争识别研究分别采用AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜在RAC、EP、CLEN、TER和DA的甲醇溶液 (500 μg/L) 中进行试验.

1.7 样品制备

猪肉样品的制备参照文献[7]的方法. 称取猪肉样品5.0 g, 绞碎, 分别加入 2.0 μg/g 和20 μg/g的RAC及其类似物标准物, 并向样品中加入10 mL乙腈和1 mL 4 mol/L的碳酸钾溶液, 使蛋白质变性. 剧烈震荡5 min, 混合物在4 ℃下, 5 000 r/min离心20 min. 上层溶液与20 mL乙腈饱和正己烷溶液混合, 除去样品中的脂肪. 震荡5 min后, 乙腈层析出, 加入20 mL饱和NaCl溶液以防止发生乳化, 震荡 2 min. 分离出乙腈相, 用Na2SO4干燥, 样品残渣用2 mL乙腈洗涤. 蒸干乙腈后, 用5 mL甲醇溶解并用AAO@MIP纳米管膜萃取. 经过甲醇和乙酸混合液 (体积比9∶1) 解吸后, 用HPLC检测, 分析样品中RAC的含量.

2 结果与讨论

2.1 氧化铝膜和莱克多巴胺印迹纳米管膜的表征

对比AAO与AAO@MIP的SEM图(图2)可知，空白的AAO膜表面光滑，而AAO@MIP膜网状表面均匀包覆了一层MIP分子，结果表明，氧化铝膜表面经过ATRP路线反应成功合成MIP纳米管薄膜.

图2 氧化铝膜和莱克多巴胺分子印迹纳米管膜的SEM图

2.2 AAO@MIP膜对莱克多巴胺的吸附容量

莱克多巴胺AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜的吸附容量测试在莱克多巴胺的甲醇标准溶液中进行, 提取时间为50 min(图3). 在100～800 μg/L的范围内, 随着多巴胺质量浓度的增大, 吸附量也增大, 并在ρ(DA)=800 μg/L时达到吸附平衡. AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜的吸附量分别为50.26 mg/g和6.89 mg/g, AAO@MIP的吸附量为AAO@NIP的7.3倍. 可见, AAO@MIP纳米管膜相比AAO@NIP对于莱克多巴胺有更高的吸附容量.

图3 AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜的吸附量

Figure 3 Extraction amounts for ractopamine of AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes

为了研究AAO@MIP的吸附平衡时间, 探讨了AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜对RAC的平衡吸附量随吸附时间的变化(图4). 在40 min内, 对RAC的吸附量快速增加, 这是因为在AAO@MIP纳米管膜的表面有大量对RAC有高度亲和力的空穴, 使得RAC再吸附的位阻减小. 随后, RAC逐渐填满结合位点, 并逐渐在50 min后到达吸附平衡. 因此, 在后续实验中选用50 min 的结合时间.

图4 AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜对100 μg/L莱克多巴胺溶液的动态吸附曲线

Figure 4 Adsorption kinetic curves of AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes for ractopamine in solution of 100 μg/L

2.3 MIP纳米管膜对莱克多巴胺的选择性

MIP纳米管膜的选择性实验采用EP、TER、CLEN和DA作为结构类似物(图5), 并配成500 μg/L溶液进行实验. AAO@MIP纳米管膜对各种类似物的吸附量比AAO@NIP纳米管膜的高(图6), 说明了选取的类似物在结构上与RAC相似. 这一结果可以证明, AAO@MIP纳米管膜的识别原理是基于模板分子的大小和结构的. 由于AAO@NIP纳米管膜并没有模板分子的特异性识别位点, 因此其吸附量明显小于AAO@MIP纳米管膜, 这一点在对于模板以及其他竞争分子的吸附没有明显的差异.

图5 莱克多巴胺及其结构类似物的化学结构

Figure 5 Chemical structures of ractopamine and its structural analogues

图6 AAO@MIP和AAO@NIP纳米管膜对500 μg/L的RAC、TER、EP、CLEN 和DA吸附量

Figure 6 Absorption capacities of RAC, TER, EP, CLEN and DA with AAO@MIP and AAO@NIP nanotube membranes at the concentration level of 500 μg/L

2.4 AAO@MIP纳米管膜的重现性试验

为测试AAO@MIP纳米管膜的稳定性和复用性, 使用 100 μg/L 的莱克多巴胺溶液对其进行了5周期的再生(吸附/解吸)实验. AAO@MIP纳米管膜采用甲醇-乙酸洗脱液. 实验测定数据相对标准偏差 (RSD) 为5.27%, 表示AAO@MIP纳米管膜有良好的稳定性和复用性.

2.5 AAO@MIP与HPLC的联用

2.5.1 分析方法的有效性 建立AAO@MIP纳米管膜萃取与HPLC联用检测莱克多巴胺及其类似物的方法：莱克多巴胺用荧光检测器检测, 而克仑特罗、特布他林、肾上腺素和多巴胺则用紫外光检测器检测. 通过不断降低加标样品的质量浓度测定其峰高, 然后算出3倍信噪比, 可得该方法的检出限. 经过优化，该分析方法的线性范围、相关系数、检出限、重现性见表1.

表1 AAO@MIP纳米管膜萃取-HPLC联用检测RAC、CLEN、EP、TER、和DA的线性范围、检出限(LOD)、相关系数(R2)和相对标准偏差(RSD)

Table 1 Linear ranges, limits of detection (LOD), correlation coefficients (R2) and RSD of AAO@MIP nanotube membrane coupled with HPLC for the detection of RAC, CLEN, EP, TER and DA

化合物线性范围/(μg·L-1)R2LOD/(μg·L-1)RSD/%RAC10～10000.99960.742.79CLEN100～10000.99971.403.49EP100～10000.99982.004.16TERDA200～1000100～10000.99790.99952.501.204.342.87

RAC的线性范围是10～1 000 μg/L, CLEN、EP和DA的线性范围为100～1 000 μg/L, TER的线性范围是200～1 000 μg/L. 检出限在0.74～2.50 μg/L. 相对标准偏差范围是2.79%～4.34%. 上述数据表明这种新型的方法在对β2-肾上腺素受体激动剂的检测中表现良好. 2.5.2 实际样品的分析 为了验证对于测定猪肉样品中RAC残留量的准确性, 往猪肉样品中加入2.0 μg/g和20 μg/g两个质量浓度梯度的RAC及其类似物的标准溶液. 在萃取之前, 猪肉样品需经过乙腈饱和的正己烷和Na2SO4去除脂肪酸和水, 排除分子识别的干扰. 随后, 分析物移入甲醇中, 并用AAO@MIP纳米管膜萃取, 并用上述方法检测分析.

AAO@MIP纳米管膜对RAC及其类似物有相当高的选择性(图7)，曲线a为 200 μg/Lβ2-肾上腺素受体激动剂标准液和猪肉样品提取液的混合液, 曲线b是经过AAO@MIPs膜萃取后再解吸的加标样品液. 表2为猪肉样品的加标结果,β2-肾上腺素受体激动剂在2个质量分数梯度下的加标回收率分别为86.32%～96.95%和87.84%～95.73%. 相对标准偏差范围在2.67%～5.72%. 结果表明, 这种方法对于复杂样品中β2-肾上腺素受体激动剂的检测结果是准确可信的.

1：克伦特罗；2：特布他林；3：肾上腺素；4：莱克多巴胺

Figure 7 HPLC-UV Chromatograms of spiked sample solution at 223 nm

表2 猪肉样品的β2-肾上腺素受体激动剂加标回收率平均值(n=3)

Table 2 Average recoveries of β2-agonists for spiked pork samples (n=3) %

3 结论

制备了一种新型的莱克多巴胺MIP纳米管膜. 使用阳极氧化铝膜作为分子印迹的微反应器的方法, 有效克服了传统印迹的缺点, 如模板洗脱不完全、 吸附容量小、传质效率低、材料形状不规则. 这种方法通过增加材料表面结合位点的数量, 显著提高了吸附容量和印迹材料的动力学. 在重复吸附实验中, AAO@MIP表现出良好的识别性能和高吸附容量. 近来, 分子印迹技术已经应用于各种各样的模板分子, 从分子量小的有机分子到多肽, 再到蛋白质, 因此, MIP纳米管膜在实现化学分离和传感具有广阔前景.

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【中文责编：谭春林 英文审校：李海航】

Novel Molecularly Imprinted Polymer Nanotube Membranes for Ractopamine

CHEN Qi1, CHEN Xiaogang1, PAN Jiahui2, SHEN Guoquan2, ZHAO Liangliang2, LIANG Yong3*

(1. Foshan University, Foshan 528231, China; 2. Department of Chemistry and Textile, Foshan Supervision Testing Center of Quality and Metrology, Foshan 528225, China; 3. School of Chemical andEnvironment, South China Normal University, Guangzhou 510006, China)

A method for the synthesis of ractopamine molecularly imprinted polymer (MIP) nanotube membranes using an anodic alumina oxide (AAO) template by surface-initiated atom transfer radical polymerization (ATRP) was presented. Methacrylic acid (MAA) was selected as functional monomer and the polymerization rate ofn(ractopamine)∶n(MAA) was 1∶6. The morphology of MIP nanotube membranes were characterized by scanning electron microscope (SEM). The SEM results showed that ATRP route works well in the formation of MIP nanotubes within AAO template. A series of adsorption experiments revealed that the MIP nanotube membranes showed better extraction capacity and good selectivity than that of non-imprinted polymer (NIP) nanotube membranes for ractopamine and its analogues. In order to evaluate the usability of the MIP nanotube membranes, a methodology by combining MIP nanotube membranes extraction coupled with high performance liquid chromatography (HPLC) detection for the determination ofβ2-agonists in complex samples was developed. The linear ranges were 10～1 000 μg/L for ractopamine, 100～1 000 μg/L for clenbuterol, epinephrine and dopamine, and 200～1 000 μg/L for terbutaline. The detection limits were within the range of 0.74～2.50 μg/L. The proposed method is suitable for the determination of traceβ2-agonists in pork samples.

molecularly imprinted polymer; anodic alumina oxide template; atom transfer radical polymerization;β2-agonists

2016-02-21 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

广东省自然科学基金项目(2014A030307008)；佛山市禅城区产学研专项资金项目(20141072018)

O652

A

1000-5463(2017)04-0039-06

*通讯作者:梁勇, 教授, Email: liangy@scnu.edu.cn.