固相萃取-液相色谱-质谱法检验人血浆中的地芬诺酯

2017-09-11栾玉静郝广宾金昌锋王爱华任昕昕

中国刑警学院学报 2017年4期

关键词：液相回收率血浆

栾玉静郝广宾金昌锋王爱华任昕昕

（1 公安部物证鉴定中心北京 100038；

2 北京市现场物证检验工程技术研究中心北京 100038；3 济南市公安局刑事科学技术研究所山东济南 250115）

固相萃取-液相色谱-质谱法检验人血浆中的地芬诺酯

栾玉静1,2郝广宾3金昌锋3王爱华1,2任昕昕1,2

（1 公安部物证鉴定中心北京 100038；

2 北京市现场物证检验工程技术研究中心北京 100038；3 济南市公安局刑事科学技术研究所山东济南 250115）

应用固相萃取结合液相色谱-质谱（SPE-LC/ MS）的方法检验人血浆中地芬诺酯。采用SPE提取血浆，用LC-MS/MS方法测定。人血浆中地芬诺酯在1ng/mL～500ng/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系（r=0.9992），最低检出限为0.1ng/mL，回收率为78.1%～92.1%，日内日间精密度均小于9.5%。该实验方法操作简单，结果准确，能满足人血浆中地芬诺酯的检验。

地芬诺酯固相萃取液相色谱-质谱中毒

1 引言

地芬诺酯，又名苯乙哌啶，氰苯哌酯，化学名称是1-（3，3-二苯基-3-氰基丙基）-4-苯基-4-哌啶甲酸乙酯（化学结构式如图1所示）[1]。当口服苯乙哌啶超过40~60mg·d-1时，有吗啡样欣快感、愉悦感，长期服用后可形成依赖，因而常被吸毒人员作为海洛因暂时替代品吸食滥用。由于地芬诺酯滥用者往往是大剂量或与多种药物合并使用，极易发生过量中毒或中毒致死。此外，由于地芬诺酯有甜味，往往会有儿童因误食中毒案件发生，且呈逐年上升的趋势[2]。

随着对传统毒品海洛因打击力度的增加和戒毒工作的全面展开，地芬诺酯滥用的报道越来越多，国内外关于地芬诺酯的检测研究大多是对临床上药物片剂的分析[3-5]，也有生物检材的检测报道[6-7]，但方法灵敏度低，检出限高。因此，建立生物检材中地芬诺酯的检验方法已成为法医毒物分析领域亟需解决的问题，不仅可为刑事相关案件中地芬诺酯的检验提供方法，也可为临床救治及监控提供基础[8]。液相色谱质谱法是目前法庭科学常用的检验生物检材中毒物的方法。本文通过固相萃取结合液相色谱质谱法建立人血浆中地芬诺酯的检验方法，解决了地芬诺酯中毒案件中的检验难题，为公安机关执法办案提供有效证据。

图1 地芬诺酯的结构

2 材料与方法

2.1 主要仪器与设备

UPLC-XevoTM TQ MS液相色谱-质谱联用仪，包括Mass Lynx数据处理系统（美国Waters公司）；SORVALLR 高速离心机（美国SORVALL公司）；BP210s电子分析天平（0.1mg~220g）（德国Satorius公司）；Vortex Genie-2 涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；EYELA CM-100高速振荡器（日本东京理化器械株式会社）；Millpore Simplicity纯水制备系统（美国Millpore公司）；10~100μL，20~200μL，10~1000μL，1~10mL自动移液枪（法国GILSON公司）；OasisR MCX固相萃取小柱（60mg，3cc）（美国Waters公司）；0.22μm有机过滤膜（北京八方公司）。

2.2 标准品、试剂与生物样本

地芬诺酯标准品（国家标准物质研究中心，纯度大于99.9%），乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，Fisher），盐酸、氨水（分析纯，北京化学试剂公司），去离子水（Milipore），空白人血浆（北京复兴医院）。

2.3 标准品储备液的配制

精密称取地芬诺酯标准品10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加少量甲醇溶解并稀释至刻度，得到1.0mg/mL地芬诺酯储备液，置于4℃冰箱存放备用。实验过程中根据实验需要，精密吸取储备液，用甲醇逐级稀释所需浓度即可。

2.4 样品处理

取1.0mL血浆样品于10mL试管中，加入0.2 mL甲醇，混旋20s，然后加1%盐酸溶液 4mL，充分混悬，离心上清液待过柱。取固相萃取MCX柱，依次以3mL甲醇、3mL水活化，然后加入样品的离心上清液，流速为1.0 mL/min~1.5 mL/min，再依次加入3 mL水、3mL甲醇和3mL乙腈淋洗，4000转/秒离心5 min，再以3 mL、5%氨水-乙腈洗脱，收集洗脱液，供仪器检测。

2.5 仪器检测条件

表1 梯度洗脱条件

表2 MS/MS条件

3 结果与讨论

3.1 线性关系考察

取空白人血浆1.0mL，在其中添加地芬诺酯储备液，使待测样品浓度分别为1、5、50、100、200、500ng/mL，按照2.4样品处理方法进行提取，LC-MS/MS测定。以峰面积（y）为纵坐标，以浓度（x，ng/mL）为横坐标作线性回归。回归方程为：y=6.185X-1.657；r2=0.9992。结果表明，地芬诺酯在浓度为1~500ng/mL范围内峰面积与浓度呈线性相关。最低检出限（S/N=3）是0.1ng/mL，检测限（S/ N=10）是1.0g/mL。

3.2 方法专属性考察

取空白血，加入一定量的地芬诺酯标准溶液，按照2.4进行样品制备，按照2.5进行分析检测，同时做空白血的对照试验，将两者的图谱进行比较（见图2和图3）。结果在地芬诺酯出峰时间段内，空白检材均未出现明显的色谱峰，表明生物检材中内源性杂质不会对地芬诺酯的测定造成干扰，说明方法具有较高的专属性。

3.3 回收率和精密度考察

取空白人血浆1.0mL，加入一定量的标准溶液储备液，制备成地芬诺酯浓度为5.0、50.0、500.0ng/mL的制备样品，每个浓度平行做5个样品，一天内早中晚分别检测3次，连续5天进行检验，得到3种浓度的回收率和日内日间精密度（见表3）。

图2 空白血的LC/MS/MS 色谱图

图3 血浆中地芬诺酯的LC/MS/MS色谱图

表3 地芬诺酯的回收率和精密度(n=5)

3.4 稳定性实验

将上述制备样品分别于0、1、5、10、24h进行测定，以地芬诺酯峰面积进行计算，RSD为0.72%。结果表明，样品在24h内基本稳定。

3.5 固相萃取条件的选择

MCX萃取柱是一种离子交换柱，其基本的原理是静电吸引，即化合物上的带电荷基团与键合硅胶上的带电荷基团之间的吸引。MCX萃取柱本身带有电荷，为了使样品中的地芬诺酯吸附到MCX萃取柱上，一定要选择合适的样品pH值。本文选用1%盐酸对生物样本进行稀释，它不仅可以使样品中的地芬诺酯处于带电状态，且有沉淀蛋白的作用。

洗脱液的选择：研究对甲醇:氨水（95:5）、乙腈:氨水（95:5）、三氯甲烷:异丙醇:氨水（78:30:2）3种洗脱溶液进行了比较。在1mL血中添加100ng地芬诺酯，平行萃取3份，按照2.5进行检测，记录回收率，结果表明后两种洗脱溶剂洗脱的萃取物相对干净，回收率较高（见表4）。由于三氯甲烷与水的互溶性差，不适用于液相系统，用三氯甲烷:异丙醇:氨水（78:30:2）进行洗脱后，需要挥去有机溶剂重新定容，步骤相对繁琐，所以本文选用与水互溶性好的乙腈:氨水（95:5）作为洗脱液。