土贝母皂苷乙诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的研究*

陈洋洋王瑞莉王 斌晁 旭△

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳712000）

土贝母皂苷乙诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡的研究*

陈洋洋1，2王瑞莉1王 斌1晁 旭1，2△

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳712000）

目的 观察土贝母皂苷乙对非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用并探讨诱导其凋亡的机制。方法 用台盼蓝染色法检测细胞的活力；MTT法检测土贝母皂苷乙对细胞的抑制率；Hoechst33342/PI荧光双染法观察细胞的形态；用流式细胞仪检测土贝母皂苷乙对细胞凋亡率的影响。结果 土贝母皂苷乙能显著抑制A549细胞的增殖，24 h的IC50为13.37 μg/mL，48 h的IC50为10.99 μg／mL，并且呈时间和剂量依赖性。Hoechst33342/PI荧光双染法观察到经土贝母皂苷乙处理的细胞核皱缩、染色体聚集，核破裂形成小体，呈现明显的凋亡现象。FCM分析结果显示，随着药物浓度的增高，细胞的凋亡率依次升高，从4.56%增加至17.62%。该研究表明土贝母皂苷乙能显著促进A549细胞凋亡，且在一定范围内呈现剂量依赖效应。结论 土贝母皂苷乙能诱导非小细胞肺癌A549细胞凋亡。

土贝母皂苷乙 A549细胞 凋亡

据GLOBOCAN2012报道，肺癌的发病率与病死率位居癌症首位，全世界有182万人为肺癌新发的病例，约占全部肿瘤的13%，有159万死亡病例，占19.4%［1］。土贝母味甜微苦、辛，性凉，归肺、脾经，具有清热解毒、消肿散结、祛痰利湿之功，能够治疗痈肿毒疮、瘰疬痰核、乳痈等。研究者从土贝母中提取分离出了皂苷、甾醇类、生物碱、有机酸、糖类等物质。其中主要活性成分是皂苷类，有16种皂苷被分离出来，研究最多的是皂苷甲、乙、丙、丁、戊［2-7］。翁昔阳等用土贝母苷甲作用鼻咽癌细胞（CNE-2Z），发现苷甲能使CNE-2Z细胞的基因Bcl-2表达下调及使Bax表达升高，诱导细胞凋亡［8］。据胡章等报告土贝母皂苷甲能抑制人早幼粒白血病细胞，使cyclin B1的表达降低［9］。刘姬艳等研究报告土贝母皂苷甲对K562有着诱其分化的作用［10］。晁旭等研究土贝母皂苷乙作用于肝癌（HepG2）细胞后，能将肿瘤细胞滞留于G2/M期，抑制肿瘤细胞的增殖和生长［11-12］。杨萍等［13］报道土贝母皂苷（含苷甲79%，苷乙21%）能抑制宫颈癌Hela细胞的生长，24 h的IC50值是20.0 μmol/L，流式结果显示能将Hela细胞阻滞在G2/M期。在浓度40 μmol/L处理时，细胞形态明显变化，出现核皱缩、核染色质凝集边聚等凋亡现象。据王长秀等报告，土贝母皂苷甲能抑制肺癌PGCL3的部分能力［14］。Yu TX报告土贝母皂苷甲、皂苷乙、皂苷丙都有抗炎、抗肿瘤及抗促瘤的能力，土贝母皂苷乙抑制肿瘤的作用比皂苷甲强，且急性毒性小于皂苷甲［15］。但是有关土贝母皂苷乙对非小细胞肺癌的抑制作用及其机制的研究尚未见报道。本研究的目的是探讨土贝母皂苷乙对非小细胞肺癌A549细胞增殖的抑制作用及诱导其凋亡的机制，为将土贝母皂苷乙开发成治疗非小细胞肺癌的制剂提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞 人非小细胞肺癌细胞A549细胞株购买于西安交通大学医学院。

1.2 药物和试剂 土贝母皂苷乙购买于宝鸡市晨光生物技术有限公司，纯度99.99%。RPMI Medium-1640培养基、MTT试剂盒、胎牛血清购买于北京solarbio生物科技有限公司，细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒购买自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 A549细胞株的培养 从液氮罐中取出冻存的细胞株，迅速放置在37℃水浴箱中，至细胞完全溶解。然后将细胞冻存管用75%酒精擦拭，移至超净台上，用巴氏吸管将细胞转移至离心管中，并加入10倍体积的RPMI-1640培养液，1000 r/min离心8 min。弃上清液，使细胞重悬于10 mL RPMI-1640培养液，然后转移至50 mL培养瓶中，轻摇均匀后放于37℃、5%CO2条件的培养箱中培养。次日更换培养液，继续培养。

1.4 MTT法检测 取对数生长期细胞，胰酶消化后制成浓度为5×104个的单细胞悬液，取180 μL，分别加入96孔培养板中，于37℃、5%CO2条件的培养箱中培养。24 h后，分别在加入20 μL相应质量浓度的土贝母皂苷乙，使培养液中最终药物质量浓度分别为5、10、20、40、60 μg/mL。对照组加入200 μL培养液。每个浓度分别安排设5个孔作为复孔。培养24、48 h后，弃去原有培养液后，每孔加入90 μL新鲜的培养液及10 μL MTT溶液，吹吸混匀。4 h之后，吸净每孔中的上清液，再加入110 μL的Formazan溶解液，在摇床上晃动10 min，使晶体充分溶解。采用RF-6100酶标分析仪，在波长为490 nm下测定吸光值（OD值）。重复3次实验并计算平均值，用抑制率 （%）＝［（对照组平均OD值-处理组平均OD值）/对照组平均OD值］×100%的公式计算抑制率，并绘制细胞生长抑制曲线图，计算出半数致死量的浓度（IC50）。

1.5 荧光双染检测 取灭菌后的盖玻片，置于六孔细胞培养板内，加入对数生长期的A549细胞，按2 mL/孔接种于6孔板中。24 h后，每孔分别加入体积为0.222 mL的土贝母皂苷乙，最终浓度为5、10、20、40和60 μg／mL；对照组加入同样的培养液。培养12 h后，弃上清，用PBS洗涤细胞2次，然后加入适量Hoechst33342染液，10 min后弃去染色液，用PBS洗2遍，再加入适量PI染液处理10 min后，PBS轻轻洗细胞1次。然后在荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.6 流式细胞仪检测凋亡率 将A549细胞悬液按每孔1×106个/mL接种于6孔板培养板中，至对数生长期，加入相应浓度土贝母皂苷苷乙溶液，继续培养24 h后收集细胞，用PBS洗涤后，离心，加入150 μL缓冲液混匀，使其浓度为1×106个/mL。加入2.5 μL AnnexinV-FITC混匀避光10 min，然后加入5 μL PI，用流式细胞仪（EpicsXL-MCL）检测其凋亡率，分析结果。

1.7 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，统计学方法采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT检测结果 见图1，图2，表1。在5、10、20、40、60 μg/mL质量浓度时，土贝母皂苷乙对A549细胞的抑制率分别为28.2%、39.7%、56.3%、78%、88.5%；对Hela细胞的抑制率分别为明显高于对Hela细胞的抑制率，说明A549细胞比Hela细胞21.9%、33.1%、41.7%、61.4%、65.3%。该结果显示A549细胞比Hela细胞对土贝母皂苷乙更加敏感。MTT检测结果显示，土贝母皂苷乙对A549细胞的IC50为13.37 μg/mL，对Hela细胞的IC50为25.78 μg/mL，说明土贝母皂苷乙诱导前者凋亡的能力比后者的强。土贝母皂苷乙作用A549细胞24 h的IC50为13.37 μg/mL，48 h的IC50为10.99 μg/mL。与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），说明土贝母皂苷乙对A549细胞的生长有抑制作用，且呈明显的时间依赖及剂量依赖性。

2.2 荧光双染检测结果 见图3。从图3中，可以看出对照组细胞的细胞核比较完整，呈均匀的分布，经土贝母皂苷乙处理的细胞核皱缩、染色体聚集，核破裂形成小体。凋亡现象较明显，初步可判断这一典型的凋亡特征能通过土贝母皂苷乙诱导产生。

2.3 流式细胞仪检测凋亡率的结果 见表2，图4～5。流式细胞分析结果显示，用质量浓度为5、10、20、40、60 μg/mL的土贝母皂苷乙处理A549细胞，早期的凋亡率分别为3.57%，11.16%，15.48%，20.87%，23.59%，晚期凋亡率分别为2.88%，10.31%，11.44%，12.45%，13.28%。与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），说明土贝母皂苷乙有明显的促进A549细胞凋亡的作用，且在一定范围内与浓度剂量呈依赖关系。

图1 土贝母皂苷乙对A549及Hela抑制率的影响

图2 土贝母皂苷乙对A549不同时间的抑制率

表1 土贝母皂苷乙对A549及Hela的抑制率结果比较（±s）

表1 土贝母皂苷乙对A549及Hela的抑制率结果比较（±s）

与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

土贝母对Hela细胞的抑制率（%）1.305±0.097 1.085±0.707 - -0.932±0.022△0.740±0.018△28.208±6.738△21.892±2.239△0.783±0.010△0.611±0.02△39.724±5.068△33.052±3.531△土贝母皂苷乙20 μg/mL组 5 0.569±0.022△0.389±0.041△56.270±2.790△△41.706±3.006△土贝母皂苷乙40 μg/mL组 5 0.285±0.013△0.186±0.174△78.046±2.212△△61.442±1.520△△土贝母皂苷乙60 μg/mL组 5 0.150±0.036△0.077±0.028△88.506±2.737△△65.256±1.379△△组别 n 土贝母对A549细胞的OD值土贝母对Hela细胞的OD值土贝母对A549细胞的抑制率（%）对照组 5土贝母皂苷乙5 μg／mL组 5土贝母皂苷乙10 μg/mL组 5

图3 土贝母皂苷乙作用A549细胞24 h后荧光双染结果

表2 流式细胞术检测土贝母皂苷乙诱导A549细胞凋亡率的影响比较（%，±s）

表2 流式细胞术检测土贝母皂苷乙诱导A549细胞凋亡率的影响比较（%，±s）

组别 n对照组 5土贝母皂苷乙5 μg／mL组 5土贝母皂苷乙10 μg/mL组 5早期凋亡率 晚期凋亡率0.504±0.124 0.614±0.123 3.572±0.188 2.882±0.165 11.158±1.110△10.306±1.308△土贝母皂苷乙20 μg/mL组 5 15.480±1.378△11.436±1.182△土贝母皂苷乙40 μg/mL组 5 20.866±1.484△12.446±1.263△土贝母皂苷乙60 μg/mL组 5 23.590±1.232△13.280±1.263△

图4 土贝母皂苷乙对A549细胞早期及晚期凋亡率的影响

图5 流式细胞仪检测A549细胞凋亡率的结果

3 讨 论

本研究通过用不同浓度的土贝母皂苷乙分别处理A549细胞、Hela细胞，分析不同浓度的土贝母皂苷乙对两种细胞的杀伤效应。结果表明，土贝母皂苷乙对A549细胞及Hela细胞都有杀伤效应，从而抑制细胞的增殖。同等浓度的土贝母皂苷乙对A549细胞的抑制作用比Hela细胞更强。

笔者用倒置显微镜观察了不同时间点土贝母皂苷乙作用于A549细胞后的形态。结果显示，土贝母皂苷乙浓度越高、处理时间越长，A549细胞死亡率越高。提示土贝母皂苷乙对A549细胞的生长有抑制作用，且呈时间及剂量依赖效应。本研究还用Hoechst及PI染液对土贝母皂苷乙处理的A549细胞进行染色，观察细胞凋亡效应。结果显示，贝母皂苷乙处理后，对照组A549细胞核完整，均匀分布；实验组细胞的核皱缩、染色体聚集，有凋亡小体形成。流式细胞术检测结果显示，随着浓度增加，细胞早期的凋亡率分别为3.57%，11.16%，15.48%，20.87%，23.59%，晚期凋亡率分别为2.88%，10.31%，11.44%，12.45%，13.28%，提示低浓度时早期与晚期的凋亡率差别不明显；当浓度增大时早期的凋亡率明显高于晚期的，说明土贝母皂苷乙在高浓度时可以诱导A549细胞早期凋亡，且与浓度有一定的依赖关系。

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Re search on Apoptosis of Nonsmall-cell Lung Cancer A549 Induced by Tubeimosides

Ⅱ CHEN Yangyang，WANG Ruili，WANG Bin，et al. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，Shanxi，Xianyang 712046，China.

Objective：To investigate the inhibitory effect of tubeimosidesⅡ on the proliferation of non-small cell lung cancer A549 cells and the mechanism of its induction.Methods：Trypan blue staining method was used to detect cell viability；MTT was used to detect the inhibition rate detection of tubeimosidesⅡ；Hoechst33342/PI double fluorescent staining method was used to to observe cell morphology；the effect of tubeimosidesⅡon cell apoptosis rate was detected with flow cytometry.Results：TubeimosidesⅡcould significantly inhibit the proliferation of A549 cells.IC50of 24 h was 13.37 μg/mL，and IC50 of 48h was 10.99 μg/mL in a time and dose dependent manner.Hoechst33342/PI fluorescence double staining method was used to observe the nuclear shrinkage，chromosome aggregation，nuclear fragmentation，and apoptosis of the treated cells.FCM analysis showed that with the increase of drug concentration，the apoptotic rate of cells increased sequentially，from 4.56%to 17.62%.This study showed that tubeimosidesⅡcould significantly promote the apoptosis of A549 cells，and showed dose-dependent effects in a certain range.Conclusion：TubeimosidesⅡ can induce apoptosis of non-small cell lung cancer A549 cells.

TubeimosidesⅡ；A549 cell；Apoptosis

R730.59

A

1004-745X（2017）08-1336-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.007

2017-05-19）

陕西省自然科学基础研究项目（2015JM8475）

△通信作者（电子邮箱：chaoxu2004@126.com）