754例I期-IIIa期可手术切除非小细胞肺癌患者EGFR和KRAS基因突变状态及其临床意义

赵静 高洁 郭李平 胡晓许 刘琦 赵金银 刘利成 姜君 王孟昭 梁智勇 徐燕 陈闽江 张力李龙芸 钟巍

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)发病率越来越高,已成为全球癌症死亡的首要原因[1-3].近20年来,NSCLC的治疗取得了飞速发展,涌现出大量新的药物和治疗手段,如分子靶向治疗[4-7]、免疫治疗[8-10]等,使患者预后大为改善.在分子靶向治疗方面,研究最成熟的当属表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR).具有EGFR敏感突变的患者,使用吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼具有更高的客观缓解率(objective response rate, ORR)、更长的无进展生存期(progressionfree survival, PFS)以及更高的生活质量.当这些一、二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐药后,若耐药机制由EGFR T790M介导,使用三代EGFR-TKIs(Osimertinib, AZD9291)亦能再次产生显著疗效.因此,对EGFR突变的准确检测显得尤为重要.目前研究主要集中在晚期NSCLC组织和血浆标本的EGFR检测.PIONEER研究[11]显示,在晚期亚裔腺癌患者EGFR突变率高达51.4%.在另外一项IGNITE研究,再次确认了晚期亚裔NSCLC腺癌EGFR突变率为49.2%,与PIONEER结果一致,非腺癌患者EGFR突变率也高达14.1%,与欧美人群中腺癌患者突变率相当.然而,对于真实世界中,可手术切除的I期-IIIa期NSCLC组织标本的EGFR突变情况尚不清楚[12,13].

另外,并非所有具有EGFR敏感突变的NSCLC患者对EGFR-TKIs表现出良好疗效.KRAS基因编码的P21蛋白位于EGFR信号通路下游,KRAS基因突变会使下游信号通路配体非依赖性持续性激活,不受上游靶向药物对EGFR的影响,导致细胞持续恶性增殖.KRAS基因突变会使NSCLC患者对EGFR-TKIs产生耐药[14],同时患者预后更差[15].多数研究认为EGFR和KRAS基因突变是相互排斥的[16-19],但是一些临床研究表明KRAS基因突变可以发生在EGFR突变型患者中,但双突变发生率低于1%.因此,同时检测EGFR和KRAS对指导NSCLC患者个体化治疗具有重要临床意义[20].

EGFR基因突变多位于外显子18-21,其中以外显子19缺失突变和外显子21L858R错义突变最为常见,约占总突变率的90%[21].KRAS基因最常见的突变方式为点突变,90%的KRAS基因突变位于外显子2的第12和13密码子位点.本研究目的旨在使用Modified AMRS PCR荧光探针法检测真实世界下,未加选择的可手术切除I期-IIIa期的NSCLC患者组织标本中EGFR和KRAS基因的热点突变状态,是否存在双突变以及基因突变与临床因素的相关性.

1 材料与方法

1.1 材料 标本来自北京协和医院病理科于2013年1月-2013年12月收集NSCLC标本,标本类型仅限于手术完整切除的标本,除外电子气管镜和穿刺活检标本,去除重复标本,共纳入754例,其中男性374例,女性380例;年龄24岁-92岁,中位年龄60岁;年龄分组:40岁以下、40岁-49岁、50岁-59岁、60岁-69岁、70岁以上患者样本分别为15例(2.0%)、53例(7.0%)、282例(37.4%)、240例(31.8%)和164例(21.7%);病理分型:腺癌623例(82.5%)、鳞癌91例(12.1%)、腺鳞癌1例(0.1%)、其他39例(5.3%).所有标本均经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋、切片及HE染色,由病理医师复阅切片明确诊断,并确定有足够的肿瘤细胞再行后续检测.

1.2 方法

1.2.1 DNA提取用 无菌刀片刮取5张-10张4 μm厚的连续石蜡切片中癌组织区域,保证肿瘤细胞含量在30%以上.石蜡组织脱蜡后用石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA.用NanoDrop 2000荧光分光光度计检测DNA的质量和浓度,所有DNA吸光度值A260/280均在1.8-2.0之间,用无DNase水将DNA稀释至0.5 ng/μL-10 ng/μL备用.

1.2.2 突变扩增系统(amplification refractory mutation system, ARMS) 荧光PCR检测以所提取石蜡样本DNA为模板,按照EGFR基因和KRAS基因突变检测试剂盒(购自于北京华大吉比爱生物技术有限公司)操作说明书步骤,应用实时荧光定量PCR仪(ABI 7300, USA)检测EGFR和KRAS基因的常见突变,所检突变包括EGFR基因L858R和exon 19del突变及KRAS基因12和13密码子突变.检测结果由两位专业的研究人员判读和分析.如果判读结果不一致,再由第三位研究员分析得出最终决定.按照双盲试验的设计原则,试验数据的记录和获得由不同的研究员独立进行.研究员对患者组织检测结果并不知晓直到统计分析.

1.2.3 测序分析 若检出EGFR和KRAS双突变的标本,采用直接测序法进行验证.针对EGFR基因19、21号外显子和KRAS基因第2号外显子设计扩增引物且在扩增引物的5'端加上M13测序引物,其中EGFR基因第19号外显子上下游引物分别为:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAATTCCCGTC GCTATC-3';5'-GGAAACAGCTATGACCGTGGGCCTGA GGTTCAGAG-3',EGFR基因第21号外显子上下游引物分别为:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTACTTGGAGGACCGT CGCTT-3';5'-CAGGAAACAGCTATGACCGCTGACCTA AAGCCACCTCC-3',KRAS基因第2号外显子上下游引物分别为:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGATACACGTCTG CAGTCAACT-3';5'-CAGGAAACAGCTATGACCGCATA TTACTGGTGCAGGACC-3'.以所提取石蜡样本DNA为模板进行PCR扩增,反应条件:95oC预变性7 min;95oC变性30 s,56oC 30 s,72oC延伸45 s,40个循环,最后72oC延伸10 min.将所得PCR产物送上海生工生物公司进行测序,使用DNAStar软件对测序结果进行比对和分析.

1.3 统计学分析 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析.针对连续变量采用独立样本t检验,针对计数变量采用卡方检验,P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 样本中EGFR、KRAS突变情况 本次检测涉及754例样本,共260例检出EGFR突变(34.5%),其中,外显子21 L858R突变124例(16.4%),外显子19缺失突变(exon 19del)142例(18.8%),有6例(0.8%)样本同时发生了L858R和19del突变.有320例样本同时进行了KRAS基因突变检测,共检出42例KRAS突变(13.1%),且全部为12号密码子突变,未检出13号密码子突变.有3例(0.9%)样本出现双突变,其中,2例为EGFR(L858R)和KRAS(G12)双突变,1例为EGFR(Exon 19del)和KRAS(G12)突变,将此3例双突变样本使用常规测序验证,结果如图1.

图 1 3例EGFR-KRAS双突变样本的DNA测序分析Fig 1 DNA sequencing data of 3 specimens with EGFR-KRAS double mutations. EGFR: epidermal growth factor receptor.

2.2 EGFR和KRAS基因突变与NSCLC临床病理特征的关系 在754例NSCLC样本中,女性EGFR基因突变率(39.5%,150/380)高于男性(29.4%,110/374),但二者没有显著性差异(P=0.076).60岁以下患者和60岁以上患者EGFR基因突变率相当[36.3%(127/350)vs 32.9%(133/404)].腺癌(38.7%, 241/623)中EGFR基因突变率明显高于鳞癌(10.0%, 9/91)和其他类型癌(25.6%, 10/39)的突变率.在其中320例NSCLC样本中,男性KRAS基因突变率(16.6%,29/175)高于女性(9.0%, 13/145),且二者具有显著差异(P=0.048).60岁以下患者和60岁以上患者KRAS基因突变率相当[17.1%(28/164)vs 15.4%(24/156)].腺癌(14.1%,36/255)中KRAS基因突变率高于鳞癌(7.7%, 2/26)和其他类型癌(10.5%, 4/38),详见表1.

2.3 基于EGFR和KRAS基因分型的单因素分析 在EGFR或KRAS基因突变阳性的样本中,EGFR阳性组的中位初诊年龄为58岁,平均年龄为(58.6±10.1)岁,KRAS阳性组的中位初诊年龄为61.5岁,平均年龄为(62.4±8.4)岁,EGFR阳性组患者年龄分布较KRAS阳性组具有年轻化趋势(P=0.031,5).在性别分布方面,KRAS阳性组的男性分布比例明显高于EGFR组(69% vs 42.3%, P<0.01).在病理类型分布方面,两组均以腺癌为主,并未发现有显著差异(P=0.228)(图2).

3 讨论

图 2 基于EGFR和KRAS基因分型的单因素分析.A: 基于EGFR和KRAS分型的年龄分布情况;B:基于EGFR和KRAS分型的性别分布情况;C:基于EGFR和KRAS分型的病理类型分布情况.Fig 2 Single factor analysis based on EGFR and KRAS genotype.A: Age distribution based on EGFR and KRAS genotype; B:Gender distribution based on EGFR and KRAS genotype; C:Pathological type based on EGFR and KRAS genotype.

表 1 EGFR及KRAS基因突变情况与患者临床病理特征之间的关系Tab 1 The relationship between EGFR and KRAS mutations and clinical variables of patients

本研究是一项专门针对I期-IIIa期可手术切除NSCLC患者EGFR和KRAS基因突变状况的调查研究.研究显示,在未加选择可切除的I期-IIIa期NSCLC患者,EGFR基因突变率为34.5%,这与早期文献[22,23]所报道的一致.但对于腺癌,此研究EGFR突变率仅为38.7%,明显低于PIONEER和IGNITE研究所报道的50%左右[11].在PIONEER和IGNITE研究中,均是纳入的IV期腺癌患者,而我们的标本为I期-IIIa期,这种早晚期标本差异可能是导致突变率不同的一个重要原因.在一项EGFR-TKIs术后辅助治疗的随机III期临床研究中(BR.19研究)[20],研究者亦发现手术标本中EGFR的突变率明显低于晚期患者,仅3%(15/503),而且分期越早的标本,其EGFR突变率越低,这些发现似乎也在一定程度上支持我们的结论.这也反映早期NSCLC和晚期NSCLC可能具有不同的生物学行为,EGFR基因在其中所起的作用不同,因此制定综合治疗策略需考虑这种差异[24,25].

既往研究[26,27]表明,EGFR突变与患者性别、种族、吸烟、病理类型有关,其在亚裔、女性、不吸烟、腺癌的患者中发生率较高.本研究在754例I期-IIIa期NSCLC样本中也发现,EGFR基因突变率在腺癌中较高,同时女性较男性也有升高趋势(39.5% vs 29.4%, P=0.076),这与既往研究结果一致.

KRAS基因是EGFR信号转导通路下游的重要节点,该基因的突变可以导致EGFR-TKI原发性耐药,同时它亦是判断NSCLC患者预后的重要指标.KRAS基因突变具有明显的地域差异,西方人群中KRAS突变率约25%,明显高于东亚人群10%,且KRAS基因突变多见于男性,吸烟以及肺腺癌[27].在本研究中,KRAS基因的突变率为13.1%,且腺癌的突变率(14.1%)高于鳞癌(7.7%)和其他类型癌(10.5%).这些发现也与既往研究[27,28]一致.

在NSCLC中同时存在EGFR和KRAS突变非常罕见,一直以来研究者认为两者互斥[16-18].但在本研究中,共有3例样本在EGFR和KRAS基因上同时发生了突变,均为女性肺腺癌患者,且经直接测序法验证,说明EGFR和KRAS双突变可以同时存在,KRAS的突变可能会导致具有EGFR敏感突变患者对EGFR-TKIs耐药.在临床中,约30% EGFR阳性NSCLC患者对EGFR-TKIs靶向治疗无应答,即发生原发性耐药[29].本研究,在320例检测EGFR和KRAS突变的样本中,EGFR的突变率为30.3%(97/320),其中在EGFR突变阳性样本中,KRAS的突变率为3.1%(3/97),其远远低于30%,说明EGFR-TKIs原发耐药除了KRAS突变外,还有很多其他机制参与,如BIM表达水平等[29].

总之,本研究提示在I期-IIIa期可手术的NSCLC样本中EGFR基因突变率低,EGFR基因突变和KRAS基因突变可同时存在.但该研究仍有较多缺陷,它是一项回顾性研究,所得结论是与其他研究结果进行比较得出,未纳入IV期标本做为对照,部分临床资料收集不完善以及EGFR检测内容不全,这些均需要在后续研究中改进和完善,并进一步验证研究结论的可靠性.