黑素皮质素受体4（MC4R）基因在5个地方鸡种中的遗传多态性分析

周艳+雷秋霞+韩海霞+李福伟+高金波+刘玮+逯岩+曹顶国

摘要：本试验采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析了黑素皮质素受体4（MC4R）基因在5个地方鸡种中的遗传多态性，结果在5个供试鸡群体中检测到两个突变位点。在NC_006089.4：g.54 C>G位点中，CC基因型在莱芜黑鸡和琅琊鸡中均没有检测到，CG杂合型在汶上芦花鸡中表现为优势基因型，突变型GG基因型在其余4个群体中表现为优势基因型，等位基因G在所有供试群体中表现为优势等位基因。在NC_006089.4：g.315位点中，GT杂合型在汶上芦花鸡中表现为优势基因型，GG野生型在其余4个群体中表现为优势基因型，等位基因G在除汶上芦花鸡以外的4个群体中表现为优势等位基因。

关键词：鸡；MC4R基因；PCR-SSCP；PCR-RFLP；遗传多态性

中图分类号：S831.2 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0127-04

Abstract The SNPs of MC4R gene in five Chinese indigenous Chicken Breeds were detected by PCR-SSCP and PCR-RFLP methods. As a result， two mutations in MC4R gene were identified. In NC_006089.4：g.54 C>G， genotype CC was not found in Laiwu Black chickens and Langya chickens， the frequency of genotype CG was higher than that of the other genotypes in Wenshang Barred chickens， and GG showed to be the advantageous genotype in the other four populations； allele G was dominant in all the five populations. In NC_006089.4： g.315， heterozygous genotype GT was advantageous in Wenshang Barred chickens， and GG was advantageous in other four populations； allele G was dominant in the four populations except Wenshang Barred chickens.

Keywords Chicken； MC4R gene； PCR-SSCP； PCR-RFLP； Genetic polymorphism

黑素皮质素受体4（melanocortin-4 receptor，MC4R）基因属于黑素皮质素受体家族，为G蛋白耦联受体超家族的一员。目前，人们已经在5个物种（人、猪、鼠、鸡和牛）中分离并克隆出所有的MCRs亚型[1]。已有研究表明，MC4R主要在控制体重、采食量和能量稳态的过程中发挥重要作用[2，3]。MC4R基因多个单碱基突变已被认为与人类肥胖病症关系密切[4-7]； MC4R-/-小鼠表现为极度肥胖[8]；猪MC4R基因被认为是影响生长肥育性状的主效基因之一[9]；中国西门塔尔牛MC4R基因表达量也被认为与背膘厚度呈显著相关[10]。

鸡MC4R基因被定位在2号染色体的2q12处，由长996 bp的单一外显子构成，编码332个氨基酸，在肾上腺、性腺、脾、脂肪等组织中广泛表达[11]。目前鸡MC4R基因的相关研究结果表明，MC4R基因对鸡生长和体组成性状有显著影响[12，13]，但对鸡脂肪性状的影响还未有定论。我国地方鸡品种资源非常丰富，以肉质鲜美而闻名，本研究采用PCR-SSCP技术和PCR-RFLP技术检测MC4R基因在我国地方鸡种中的遗传多样性，以期为我国地方鸡种的创新利用提供科学资料和理论依據。

1 材料与方法

1.1 试验材料

5个地方鸡种汶上芦花鸡（WL）、济宁百日鸡（JB）、莱芜黑鸡（LH）、琅琊鸡（LY） 和石岐杂鸡（SQZ）均来自山东省地方鸡品种资源活体基因库，饲养全阶段由专人管理，营养水平一致。每品种随机抽取30只个体，公母各半，翅静脉采血，EDTA抗凝，酚/氯仿抽提基因组DNA。-20℃保存备用。

1.2 引物设计

根据鸡MC4R基因DNA序列（GenBank号： NC_006089.4），采用Primer Premier 5.0和Oligo 6软件设计P3引物，P2引物参考李国辉等[14]扩增外显子区域，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。引物2为SSCP引物，扩增目的片段长度为210 bp，引物3为FbrⅠ酶切引物，目的片段长度为610 bp。各引物序列如下：

P2F：5′CCATAAGATGAATTTCACCCAG3′，

P2R：5′TTGCCACAATGACCAAGACG3′；

P3F：5′TAGCCAAGAACAAGAACC3′，

P3R：5′GGGCAGGAGATGTAGAAA3′。

1.3 PCR扩增

PCR扩增体系（10 μL）：2×Taq PCR MasterMix（北京天根）5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物（10 pmol/μL） 各0.3 μL，模板DNA（50 ng/μL）0.8 μL。

PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55.6℃（P2）/50.6℃（P3）40 s，72℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。endprint

1.4 PCR-SSCP分析

10 μL引物2的PCR产物98℃变性8 min后，冰浴5 min，12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Bis=29∶1）电泳，250 V电泳30 min后160 V继续电泳16～17 h。电泳结束后进行银染显带并记录结果。

1.5 PCR-RFLP分析

酶切反应体系15 μL，其中FbrⅠ内切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer G 1 μL，P3引物PCR产物8 μL，ddH2O 5.5 μL，37℃恒温水浴过夜。

电泳检测：2.5%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V电泳1 h，于紫外灯下观察并拍照，检测酶切产物。

1.6 序列分析

经PCR-SSCP和PCR-RFLP基因分型后，每个基因型取两个不同个体的PCR扩增产物在济南科益科技有限公司进行独立测序。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用设计的两对引物对5个地方鸡种的基因组DNA进行扩增，所得PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。引物2的扩增片段长度为210 bp，引物3的扩增片段长度为610 bp，扩增条带均单一、明亮，片段长度符合预期要求，无非特异性条带产生，可以用于后续分析。

2.2 基因分型结果

在12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件下，对5个地方鸡种引物2的PCR产物进行SSCP分析，对引物3进行FbrⅠ酶切检测，结果每对引物各检测到 3种基因型，具体见图2。

引物2的3种基因型分别命名为CC、CG、GG。引物3的分别命名为GG、GT、TT，其中TT型条带为244、208、112 bp和46 bp，GG型条带为320、244 bp和46 bp，GT型条代为320、244、208、112 bp和46 bp。

2.3 不同基因型个体的序列测定结果

测序结果（图3）表明， P2引物和P3引物位点多态性均由该段序列中的1个核苷酸的点突变造成， 分别为54 bp处发生点突变C→G（反向测序）， 命名为NC_006089.4：g.54 C>G和315 bp处发生点突变由G→T，命名为NC_006089.4：g.315 G>T。我们将与GenBank发布序列一致的纯合基因型命名为野生型，根据这个原则，NC_006089.4：g.54 C>G位点，基因型CC为野生型，GG为突变型；NC_006089.4：g.315 G>T位点GG为野生型，TT为突变型。

2.4 各多态位点的基因型频率和等位基因频率

对汶上芦花鸡、莱芜黑鸡、济宁百日鸡、石岐杂鸡和琅琊鸡进行了MC4R基因两个多态位点的基因型检测，计算了各品种的基因型频率和等位基因频率，结果见表1。

由表1可知，在NC_006089.4：g.54 C>G多态性位点中，CC基因型在莱芜黑鸡和琅琊鸡中均没有检测到，CG杂合型在汶上芦花鸡中表现为优势基因型，突变型GG基因型在其余4个群体中表现为优势基因型，等位基因G在所有供试群体中表现为优势等位基因。在NC_006089.4：g.315多态位点中，GT杂合型在汶上芦花鸡中表现为优势基因型，GG野生型在其余4个群体中表现为优势基因型，等位基因G在除汶上芦花鸡以外的4个群体中表现为优势等位基因。

3 讨论与结论

中枢黑皮素神经系统在摄食行为及能量代谢中起着重要作用，而MC4R基因在这个复杂的信号通路中起关键作用，其V103I突变被证实与人类肥胖密切相关[15，16]。刘桂兰等[17]研究表明MC4R基因多态性与猪平均背膘、腰椎间膘厚等脂肪性状显著相关，李长龙等[18]也证实MC4R基因多态性与猪肌内脂肪和背膘都有显著相关性。除与脂肪性状密切相关外，MC4R基因多态性也被表明与兔[19]、鸽[20]和鹅[21]的生长及体组成相关。李国辉等[14]在培育品种京海黄鸡中检测到MC4R基因的2个突变位点，随后陶勇等[22]分析了其中一个位于编码区662位点的突变与京海黄鸡生长性能的相关性，結果表明该位点突变与京海黄鸡4、8、12和16周龄体重显著相关。

本研究分析了MC4R基因的两个突变位点共6种基因型在5个地方鸡种中的分布，结果表明所检测的两个突变位点在5个供试群体中的多态性并不丰富，NC_006089.4：g.54 C>G多态性位点CC基因型在莱芜黑鸡和琅琊鸡中均没有检测到，这与陶勇等[22]、李国辉等[14]就该位点在京海黄鸡中的研究结果一致，表明该位点在我国部分地方鸡种及其培育品种中的分布基本一致。值得注意的是，所检测的两个突变中，汶上芦花鸡的优势基因型均与其他4个地方鸡种表现不一致，这是否暗示汶上芦花鸡与其他鸡种的遗传距离较远还需进一步验证。但在所有5个地方鸡种中，两个突变位点的优势等位基因表现一致，而我国地方鸡种以肉质鲜美而闻名，所以本研究检测到的优势基因型和等位基因可否作为肉质性状的分子标记应用于我国地方鸡种的创新利用有待于进一步验证。

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