斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr5的结构功能分析

刘惠芬+衣葵花+刘文光+李智峰+李云芝

摘要：对斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ（SpltNPVⅡ）基因组DNA中的同源重复区hr5的结构功能进行研究。结果表明，SpltNPVⅡ hr5大小为389 bp，含有3个64 bp不完全回文序列，回文序列的中心均含有1个PvuⅠ限制性酶切位点，并且存在1个与病毒基因组DNA复制相关的motif（CGATT）基序。瞬时表达分析表明，hr5在野生型病毒感染和未感染的细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能；实时荧光定量PCR结果显示，hr5在野生型病毒作为辅助病毒时，具有基因组DNA复制起始原点的功能。研究证明SpltNPVⅡhr5具有复制起始原点和增强子的双功能作用。

关键词：斜纹夜蛾；核型多角体病毒；同源重復区；增强子

中图分类号：S433.4：Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）08-0099-05

Abstract The structure-function of homlogous region 5 （hr5） from Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus Ⅱ（SpltNPVⅡ）was studied in this paper. The results showed that the length of hr5 is 389 bp consisting of three 64-bp imperfect palindromes，and each palindrome contains a PvuⅠ site in the center and one motif （CGATT）which related to the replication of genomic DNA of virus. A transent expression assay demonstrated that the expression of SpltNPVⅡ-ie1 promoter-driven luciferase gene was enhanced by hr5 in both infected and uninfected Spli221 cells. Real-time PCR confirmed that the hr5 could function as ori of viral DNA replication in infected cells with wild type virus as the helper virus.The study results indicated that SpltNPVⅡhr5 is bifunctional， having both ori and enhancer activities.

Keywords Spodoptera litura； Nucleopolyhedrovirus； Homologous region （hr）； Enhancer

斜纹夜蛾（Spodotera litura）是一种杂食性的重要农业害虫，全国各地均有分布。该虫广泛危害水稻、玉米、棉花、花生、烟草等数十种粮食和经济作物，近年来对蔬菜、花卉、草坪等的危害特别严重[1]。目前，在各种化学合成杀虫剂严重污染环境、农作物的高毒农药残留问题日显严重及害虫对化学杀虫剂的抗性日益增强的情况下，对斜纹夜蛾进行生物防治就显得尤为重要和迫切[2]。斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型（Spodotera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPVⅡ）分离株是一种繁殖率和毒力极强的病毒变异株，作为生物杀虫剂具有很高的研究价值和良好的应用前景。

1984年，Blinov等[3]最早报道了大蜡螟核型多角体病毒（Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus，GmMNPV）的BamHⅠ-H片段带有一个同源重复区（homologous repeat regions，hrs），即复制起始原点。之后，hrs作为基因组DNA复制起始原点（origin of replication，ori）在众多杆状病毒中得到证实。大量研究结果表明，hrs除作为DNA复制起始原点外，还具有较强的增强子功能[4-6]。家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因组中hr5不仅在宿主细胞中具有复制起始原点功能，在苜蓿尺蠖核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染的非宿主Sf细胞中亦可得到复制，而且hr5在Sf细胞/AcMNPV系统中的复制功能要比在BmN细胞/BmNPV系统中高一些；另外，BmNPV hr3在Sf细胞/AcMNPV系统中的增强子功能也要高于BmN细胞/BmNPV系统[7]。Felipe等[8]的研究结果表明美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HycuNPV）基因组中的hr6在5种鳞翅目昆虫细胞（BmN-4、Ld652Y、Sf9、SpIm、TN368）和双翅目昆虫细胞（S2）中，均能够分别增强HycuNPV ie1（hycu-ie1）、黄杉毒蛾核型多角体病毒（Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus，OpMNPV） ie2（op-ie2）和果蝇热休克蛋白70基因（Drosophila heat shock protein，hsp70）启动子的活性。上述研究结果表明，杆状病毒hrs在宿主和非宿主细胞中均具有复制起始原点和增强基因启动子转录活性的功能。然而，关于斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱhr5的结构目前尚无报道，其功能尚不明确。endprint

本研究以SpltNPVⅡ为研究材料，采用实时荧光定量PCR以及瞬时表达分析等方法，对SpltNPVⅡ同源重复区hr5在宿主细胞Spli221中的复制起始原点和/或增强子功能进行研究，以期加深和丰富对杆状病毒增殖机制的认识，同时，为研制高效、宽宿主域杀虫病毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SpltNPV Ⅱ原始细胞纯化毒株（BV）由日本岐阜县生物产业技术研究所Kamiya K博士馈赠，本实验室保存。斜纹夜蛾TUAT-Spli221细胞由日本名古屋大学资源昆虫研究室Kobayashi M教授提供，本实验室保存。

pUC-19质粒载体、pGL3-Basic质粒载体、受体菌E. coli TOP10由本实验室保存。各种限制性内切酶、配套buffer，T4 DNA连接酶及buffer，dNTPs和荧光素酶报告基因分析试剂盒均购自Promega公司。Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。寡核苷酸引物的合成和DNA测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 SpltNPVⅡ纯化 在斜纹夜蛾幼虫4龄初期注射感染细胞纯化毒株（BV），让病毒在虫体内繁殖扩增。待虫体发病后收集感染病虫的尸体进行研磨，用蒸馏水反复清洗，利用差速离心的方法纯化多角体病毒。

1.2.2 SpltNPVⅡ基因组DNA的提取 按照文献[9]提取SpltNPV Ⅱ基因组DNA。

1.2.3 SpltNPVⅡ基因组DNA hr5的序列分析 利用ClustalW、DNAMAN、Lasergene 7.1和MEGA 4等生物软件对SpltNPVⅡ hr5序列进行分析。

1.2.4 SpltNPVⅡ基因组DNA hr5功能质粒的构建 设计特异性引物（见表1），以SpltNPVⅡ基因组DNA为模板，扩增ie1基因上游510 bp的启动子区，克隆至载体pUC-19中，测序正确后亚克隆至载体pGL3-Basic中得到质粒pSp-ie1P/luc+。扩增SpltNPVⅡ hr5序列，连接pEASY-T3载体，测序正确后亚克隆至载体pUC-19中，用于hr5复制起始原点功能的检测。并将其亚克隆到pSp-ie1P/luc+质粒中ie1基因启动子的下游，得到质粒pSp-ie1P-hr5/luc+（图1），用于检测hr5是否有增强ie1基因强启动子的活性。

1.2.5 瞬时表达分析 将构建的重组功能质粒DNA分别转染野生型病毒SpltNPVⅡ感染和未感染的Spli221细胞，培养48 h，用细胞刮将贴壁细胞刮下，5 000 r/min离心5 min，收集细胞。加入适量磷酸缓冲液PBS，重悬细胞后，5 000 r/min离心5 min，弃上清，如此反复清洗细胞2～3次。加入细胞裂解液将细胞重悬，裂解5～10 min，使之充分裂解。在每个样品管中装入100 μL的荧光素酶反应底物（luciferase assay reagent），加入20 μL细胞裂解混合液，振荡混匀。将样品放入荧光仪，按照设定程序开始测量读数[10]。设置三组重复试验。以只含ie1基因强启动子的pSp-ie1P/luc+质粒作对照。

1.2.6 实时荧光定量PCR 将构建的重组功能质粒DNA转染感染野生型辅助病毒SpltNPVⅡ的Spli221细胞。48 h后收集细胞，提取细胞总DNA，经DpnⅠ酶切后，进行实时荧光定量PCR，并制作标准曲线，计算出每微克DNA扣除对照质粒（pUC-19）拷贝数后所含目的重组质粒的拷贝数。实时荧光定量PCR方法详见文献[11]。

2 结果与分析

2.1 SpltNPVⅡ同源重复区hr5序列分析

用DotPlot软件分析表明斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型基因组DNA包含有7个同源重复区（hrs）。其中SpltNPVⅡhr5最小，为389 bp，位于基因组78 945～79 333 bp、ORF79～ORF80之间。hr5含3个64 bp不完全回文序列：TTTTAGTACATGATCTTTGCTTTCATCGAGACCTGTGGATGAAATCCAACATCAAGTATGAAAA（图2），其序列的核苷酸一致性高达90%以上，回文序列的中心均含有1个PvuⅠ限制性酶切位点，并且存在1个与病毒基因组DNA复制相关的motif（CGATT）基序（图3）。

2.2 功能质粒的酶切鉴定

为了检测SpltNPVⅡhr5是否具有复制起始原点以及激活并增强ie1基因强启动子活性的功能，以SpltNPVⅡDNA为模板，PCR扩增ie1基因启动子和hr5序列，扩增片段大小分别为550 bp和 450 bp，将其分别克隆至载体pUC-19和pGL3-Basic中，获得重组质粒pUC19-ie1P和pSp-ie1P-hr5/luc+，经酶切鉴定，电泳条带与预期大小一致（图4）。

2.3 SpltNPVⅡ同源重复区hr5增强子功能分析

采用构建的功能质粒（pSp-ie1P-hr5/luc+）转染Spli221细胞，进行病毒感染和未感染两组瞬时表达分析试验，质粒转染细胞48 h后测定细胞裂解液的荧光素酶活性。检测结果表明，含有hr5的功能质粒在野生型病毒感染和未感染的细胞裂解液的光量子数分别为：1.2×105±3.7×104 CPM和7.6×104±8.1×103 CPM，均是对照质粒pSp-ie1P/luc+转染细胞的3倍多（表2）。结果显示hr5在野生病毒感染和未感染的细胞中均具有增强早期基因ie1强启动子活性的功能。

2.4 SpltNPVⅡ同源重复区hr5复制功能分析

一般大肠杆菌菌株均是dam+，从这些菌株中制备的质粒DNA序列G*ATC中的A是完全甲基化的，而在真核细胞中复制的DNA序列G*ATC中的A则是不完全甲基化的。而DpnⅠ酶切位点G*ATC中的A必须是完全甲基化的。因此，可利用DpnⅠ酶的这种特性来区别是转染细胞质粒中的DNA，还是真核细胞中复制出来的DNA片段。利用DpnⅠ内切酶的这个特性來检测SpltNPVⅡ的同源重复区hr5在Spli221细胞中复制的功能，经实时荧光定量PCR检测，结果表明SpltNPVⅡhr5的复制效率（拷贝数）为1.52×105 copies/μg DNA，对照质粒pUC-19的复制效率（拷贝数）仅为1 730±70 copies/μg DNA，初步证明hr5在野生型病毒SpltNPVⅡ作为辅助病毒时，具有基因组DNA复制起始原点功能。endprint

3 讨论与结论

本研究对斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株基因组DNA中的同源重复区hr5序列分析表明，hr5含有3个64 bp不完全回文基序，在回文序列的中心均含有一个PvuⅠ限制性酶切位点。这一特性与AcMNPV的hrs类似，AcMNPV基因组含有9个hrs，每个hr含有5个至8个以EcoRⅠ位点为核心的30 bp不完全回文序列[12]。Pearson等[13]率先证实AcMNPV的hr5是DNA复制起始原点，之后Leisy等[14]发现AcMNPV hr1a回文序列中心的四个核苷酸序列是hr作为复制起始原点必需的结构。同时，杆状病毒的hr序列被证实具有增强子效应，无论方向和位置对极早期和晚早期基因的启动子转录均有很强的促进作用[15，16]。本研究利用瞬时表达分析和实时荧光定量PCR等方法，证实了SpltNPVⅡhr5具有复制起始原点和增强子的双功能作用。

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