基于DNA条形码技术的维吾尔药材桑葚基原鉴定研究

樊丛照 徐建国 李亚伟 李晓瑾

[摘要]該研究通过分析多途径来源的新疆桑属植物及药材样本的ITS2，psbAtrnH序列，为药材分子鉴定提供依据。以51个新疆桑属植物及药材为样本，对其ITS2，psbAtrnH序列进行PCR扩增和测序，用MEGA 60计算其种内、种间Kimura 2parameter（K2P）距离，分析变异位点，并构建NJ鉴别树。ITS2序列分析结果显示，桑Morus alba、鞑靼桑M alba var tatarica、黑桑M nigra种内无变异；桑与鞑靼桑种间无变异；桑与黑桑种间存在13个变异位点，种间平均KP2遗传距离为004；桑与药材样本间无信息变异位点，NJ鉴别树可将桑及鞑靼桑与黑桑区分。psbAtrnH序列分析结果显示，桑与黑桑种内各有1个变异位点，3种植物种间存在插入/缺失变异，可相互区分；种间变异与药材样本内变异一致。因此，ITS2序列可将来源于桑、鞑靼桑的药材样本与黑桑区分，psbAtrnH序列可将来源于三者的药材样本区分，为维吾尔药材真伪鉴别及市场监管提供依据。

[关键词]维吾尔药； 桑； DNA条形码； ITS2； psbAtrnH

Identification of origin plant of Uygur medicine mulberry

based on DNA barcode

FAN Congzhao1， XU Jianguo1， LI Yawei2， LI Xiaojin1*

（1Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia State Administration of Traditional Chinese

Medicine， Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Ethnic Medicine Resources， Urumqi 830002， China；

2 Testing Center of Xinjiang Entry Exit Inspection and Quarantine Portal， Urumqi 830063， China）

[Abstract]To provide molecular evidence for medical material identification， we analyzed the nucleotide sequence of ITS2， psbAtrnH gene in Morus genus plants and commercial products which were obtained from different places in Xinjiang The sequence of ITS2 and psbAtrnH in fiftyone samples were amplified and sequenced， MEGA 60 was used to analyze the intra and interspecific K2P distances， neighborjoining （NJ） tree was used to constructing clustering tree ITS2 sequence analyzed results showed that there is no intraspecific variation among Morus alba， M alba var tatarica and M nigra， but 13 variations sites were exist between M alba and M nigra and their interspecific K2P distances was 004， which indicated that there had significant variation in them We didn′t find informative variation sites between Morus genus plants and commercial products， and we also found that M nigra can be distinguished from other two species by NJ Tree PsbAtrnH analysis results showed there was only one variation site between M alba and M nigra， but insertion or deletion variation were remarkable evidence among M alba， M alba var tatarica and M Nigra Interspecific variation was accordance with intraspecific variation of commercial products So ITS2 and psbAtrnH gene were important marker for M alba， M alba var tatarica and M nigra identification This study provided important evidence for Uygur medicine identification and market supervision

[Key words]Uygur medicine； mulberry； DNA barcode； ITS2； psbAtrnHendprint

与汉民族“前不栽桑，后不栽柳”的习俗不同，维吾尔族民居具有庭院中栽种桑树的传统[1]，新疆桑树种质资源丰富，不同产地性状存在差异，种和品种之间的划分界限模糊不清。新疆民间通常以桑椹的颜色或桑花的性别为依据，把桑树分为黑桑、白桑、粉桑及公桑、药桑5个类型[2]，《新疆植物志》将其分为白桑Morus alba、黑桑M nigra及变种鞑靼桑M alba var tatarica[3]。桑属植物具有重要的药用价值，《中国药典》及《新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范》均收载桑M alba为基原植物[45]，其药性为一级湿热，主治干寒性或黑胆质性疾病，黑桑虽未载入质量标准，亦作为维吾尔常用药材使用，但其药性为一级干二级寒，主治热性或血液质性和胆液质性疾病，药性与功能均与白桑存在一定的差异[67]，因此二者不能混用。

正确的药材基原是保证药材质量及疗效的前提，维吾尔药材质量控制水平整体较低，市售药材基原不明极为常见[8]。维吾尔药材桑葚多来源于民间贸易，不同植物来源的桑葚药材形态特征相近，临床应用时不易区分，具有潜在的隐患。利用传统的基原鉴定和性状鉴定难以准确快速地进行鉴别。DNA条形码技术具有通用性强、鉴定结果可靠、重复性良好等优点，被广泛用于中药民族药材鉴定中[9]。《中国药典》2015 年版已将DNA条形码ITS2及psbAtrnH序列作为候选序列收载[10]。本研究拟采用ITS2及psbAtrnH序列，通过分析多途径来源的桑属植物及药材样品，建立维吾尔医常用药材桑及其近缘种的鉴定方法，为维药桑葚的质量控制及标准制定提供科学的依据，为正确合理利用维吾尔药材资源提供理论基础。

1材料

51份实验样品包括叶片30份、药材样品21份，基原植物由中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员及新疆维吾尔自治区中药民族药研究所王果平副研究员鉴定，凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆（新疆XTNM），实验所获得基原植物的单倍型序列已提交至GenBank，见表1。

PCR扩增所用引物ITS2序列由上海生工生物工程合成，ITS2正向序列：5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′，反向：5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT3′；DNA提取试剂盒、DNA聚合酶及dNTP等均购自天根生物；psbAtrnH正向序列：5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC3′，反向：5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3′[11]。DNA提取试剂盒、DNA聚合酶及dNTP等均购自天根生物（Tiangen Biotech Co）。

DNA提取研磨仪GT100（GRINDER，中国），Anker TGL16C离心机（上海安亭科学仪器）； PCR扩增仪为070851（An Analytik Jena company，德国）。

2方法

21DNA提取及检测称取干燥叶片或果实30 mg，DNA提取研磨仪1 000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取试剂盒提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

22PCR扩增及测序PCR反应体系、反应条件、序列拼接、序列注释及分析对比参照Chen等研究结果[12]；使用MEGA 60分析序列，计算种内及种间遗传距离，用NJ法构建聚类树[13]。

3结果与分析

31序列信息ITS2序列分析结果显示，桑为1个单倍型，长度236 bp，GC量631%；鞑靼桑序列信息与桑一致，黑桑单倍型数为1，长度为236 bp，GC量为610%；药材样本有2个单倍型，序列长度为236 bp，GC量为610%，631%。PsbAtrnH序列分析结果表明，桑有2个单倍型，长度为452 bp，GC量为239%，241%；鞑靼桑为1个单倍型，序列长度为470 bp，GC量234%；黑桑单倍型数为2，序列长度458 bp，GC量236%，234%；药材样本有3个单倍型，序列长度分别为452，458，470 bp，GC量分别为234%，236%，239%，见表2。

32种内及种间K2P遗传距离在ITS2序列中，桑、韃靼桑及黑桑种内K2P遗传距离均为0，药材样本内K2P遗传距离为004；桑与鞑靼桑种间无变异，两者与黑桑种间K2P遗传距离为004；桑、鞑靼桑、黑桑与药材样本之间的K2P遗传距离均为0～004，药材与植物种内种间K2P遗传距离差异不显著。根据psbAtrnH序列分析结果，鞑靼桑种内K2P遗传距离为0，桑、黑桑种内K2P遗传距离均为0002，药材样本内K2P遗传距离为0～0002；桑、鞑靼桑、黑桑种间K2P遗传距离变化范围为0001～0002，三者与药材之间K2P遗传距离变化范围0～0004，种内种间K2P遗传距离无显著差异，见表3。

33种内及种间变异位点分析新疆桑属植物及其药材ITS2序列比较后，共有13个变异位点，见表4。包括9个转换/颠换突变和4个插入/缺失变异，13个变异位点的碱基差异均可以将桑与黑桑区分开；药材样本中变异位点包括了桑与黑桑2种类型。

PsbAtrnH序列总变异位点数为27，见表5。包括3个转换/颠换突变和24个插入/缺失变异，桑种内474位点存在A/C变异，黑桑种内73 bp位点存在G/T变异。66～71 bp位点的AATATT插入/缺失变异可将黑桑与其桑、鞑靼桑区分，425～442 bp位点的插入缺失变异能将鞑靼桑与桑、黑桑区分。

34桑属植物NJ树鉴别采用NJ树法鉴定，基于ITS2序列，桑、鞑靼桑可以与黑桑区分，但桑与鞑靼桑无法区分，与编号YC125006为相同序列类型的药材均与桑、鞑靼桑聚在一起，与编号YC125001为相同序列类型的药材均与黑桑聚在一起；基于psbAtrnH序列，黑桑单独聚为一支，并与编号为YC125001的药材聚在一起，见图1，2。endprint

4讨论

41DNA条形码的选择桑树是一种集食用、药用、生态保护等多种经济价值为一体的经济树种[14]，在中国已经具有5 000多年的栽培历史[15]，长期的栽培和广泛的地理分布使其种间杂交严重，分类至今存在争议[16]，因此传统的形态学在区分不同种植资源存在一定的难度，桑M alba的干燥果实作为药材，仅凭外观性更是状难以与桑属其他种类的果实区分。诸多研究者通过遗传多样性、核糖体序列及叶绿体序列分子标记方法对不同来源的桑树资源进行了鉴定[17]，虽然研究表明ITS序列区分不同种类的桑树具有较高的效率，但ITS2序列在药材样品扩增中效率更高[18]，此外psbAtrnH序列是进化速率最快的叶绿体间隔区之一，作为植物DNA条形码的候选片段，psbAtrnH序列具有引物通用性较好、扩增成功率较高，为单亲遗传，不存在序列杂合的影响[1922]等特点，因此本研究将ITS2及psbAtrnH序列作为候选DNA条形码对不同来源的桑属植物样本和药材进行鉴定。

42DNA条形码可成功鉴定不同来源的药材桑葚本研究选择DNA条形码ITS2，psbAtrnH等2条序列对不同来源的新疆桑属植物样本和药材桑葚进行鉴定，结果表明，无论从叶片还是从药材桑葚中均可成功提取基因组DNA，扩增效率均为100%。种间变异及NJ树鉴定结果表明，ITS2序列可以鉴定药材桑与黑桑，但不能将桑与鞑靼桑区分开，作为变种其是否可以与桑同等入药还未见此类报道；psbAtrnH序列中的插入/缺失变异能成功鉴定来源于桑、鞑靼桑及黑桑的药材，但插入缺失变异无法在NJ鉴别树种表现出来。因此，ITS2与psbAtrnH片段结合使用，可成功鉴定来源于桑、鞑靼桑和黑桑的药材。

43DNA条形码可为维吾尔药材桑葚的正确应用提供依据相比中药材，维吾尔药材来源更为复杂，在长期的用药过程中由于翻译错误、鉴定错误、代用混用等原因，药材质量标准整体偏低，药材监管难度大[8]，诸多维吾尔药材的来源无法追溯，考证难度较大。本研究所收集的药材桑葚主要来源于维吾尔医药市场，鉴定结果表明，市场中的药材包括桑、鞑靼桑和黑桑，黑桑与桑属于不同的药材种类，药效药性也存在差异，长期误用混用不仅影响了维吾尔药材标准的权威性，也造成了潜在的用药安全隐患。DNA条形码技术可以追溯药材的基原，快速准确的鉴定维吾尔药材，在今后药材来源、标准制定、药材流通和市场管理等实际应用中具有重要的价值。

[参考文献]

[1]卢红， 左少纯， 吴丽莉， 等 新疆维吾尔庭院桑文化内涵与文化经济模式思考[J]. 蚕学通讯， 2014， 34（3）： 8.

[2]张思春， 朱美武 新疆的桑树资源[J]. 中国蚕业， 1995， 12（1）： 44.

[3]新疆植物志编辑委员会 新疆植物志第1卷[M] 乌鲁木齐： 新疆科技卫生出版社， 1992： 218.

[4]中国药典一部[S] 2015： 300.

[5]新疆维吾尔自治区食品药品监督管理局 新疆维吾尔自治区中药维吾尔药饮片炮制规范[S] 2010： 214.

[6]国家中医药管理局中华本草编委会 中华本草·维吾尔药卷[M] 上海： 上海科学技术出版社， 2005： 263.

[7]刘勇民 维吾尔药志[M] 乌鲁木齐： 新疆科技卫生出版社， 1999： 701.

[8]苏来曼·哈力克， 孙磊， 沈晓丽，等 维吾尔药质量标准现状分析及发展建议[J]. 中国药事， 2015（12）： 1256.

[9]陈士林， 姚辉， 韩建萍， 等 中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J]. 中国中药杂志， 2013， 38（2）： 141.

[10]中国药典四部[S] 2015：383.

[11]陈士林 中药DNA条形码分子鉴定[M] 北京： 人民卫生出版社， 2012： 14.

[12]陈士林， 庞晓慧， 姚辉， 等 中药DNA条形码鉴定体系及研究方向[J]. 世界科学技术——中医药现代化， 2011（5）： 747.

[13]Koetschan C， Hackl T， Müller T， et al. ITS2 Database Ⅳ： interactive taxon sampling for internal transcribed spacer 2 based phylogenies[J]. Mol Phylogenet Evol， 2012， 63（3）： 585.

[14]Priya S Medicinal values of mulberryan overview[J]. J Pharmacy Res， 2012， 5： 3588.

[15]He N， Zhang C， Qi X， et al. Draft genome sequence of the mulberry tree Morus notabilis[J]. Nat Commun， 2013， doi： 101038/ncomms3445.

[16]Burgess K S， Morgan M， Deverno L， et al. Asymmetrical introgression between two Morus species （M alba， M rubra） that differ in abundance[J]. Mol Ecol， 2005， 14： 3471.

[17]Zeng Q， Chen H， Zhang C， et al. Definition of eight mulberry species in the genus Morus by internal transcribed spacer based phylogeny[J]. PLoS ONE， 2015， 10（8）： e0135411.

[18]Fan C Z， Li X J， Zhu J， et al. Endangered Uyghur medicinal plant ferula identification through the second internal transcribed spacer[J]. EvidBased Compl Alt， 2015， 2015（1）： 1.

[19]Li X W， Hu Z G， Lin X H， et al. Highthroughput pyrosequencing of the complete chloroplast genome of Magnolia officinalis and its application in species identification[J]. Acta Pharm Sin， 2012， 47： 124.

[20]Shaw J， Lickey E B， Beck J T， et al The tortoise and the hare Ⅱ：Relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis[J]. Am J Bot， 2005， 92（1）： 142.

[21]Kress W J， Efickson D L A twolocus global DNA barcode for land plants： the coding rbcL gene complements the noncoding trnHpsbA spacer region[J]. PLoS ONE， 2007， 2（6）： e508.

[22]Fazekas A J， Burgess K S Kesanakurti P R， et al Multiple muhilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well[J]. PLoS ONE， 2008， 3（7）： e2802

[責任编辑吕冬梅]endprint