舒血宁注射液不良反应及其致敏物质筛选研究

易艳++李春英++张宇实++赵雍++王连嵋++潘辰++刘素彦

[摘要]该研究通过豚鼠主动全身过敏试验和大鼠被动皮肤过敏试验及小鼠类过敏试验初步判定舒血宁注射液（Shuxuening injection，SXNI） 的“过敏反应”可能不一定是IgE介导的真正的过敏反应，而是以类过敏反应为主，并进一步证明SXNI的类过敏反应有一定的批间差异和剂量依赖性，建议建立SXNI类过敏反应检测法，对每批生产的产品进行类过敏反应检测，及时发现并控制产品风险，另外临床使用时应严格控制剂量浓度。接着又对舒血宁注射液中的主要单体成分及银杏提取物的不同流分进行了小鼠类过敏反应检测，结果证明舒血宁注射液中致敏物质可能主要存在于主要含黄酮醇苷的YXY3流分中，最后对YXY3进行了进一步化学分离得到4个化学组分，小鼠类过敏试验证明其中YXY31和YXY32是舒血宁注射液中的主要致敏成分，但其具体化学成分还有待后续试验进行深入研究。

[关键词]舒血宁注射液；过敏反应；类过敏反应；致敏物质

Adverse reaction and screening of sensitizing substance of

Shuxuening injection

YI Yan， LI Chunying， ZHANG Yushi， ZHAO Yong， WANG Lianmei， PAN Chen， LIU Suyan，

TIAN Jingzhuo， HAN Jiayin， LIANG Aihua*

（Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety of Chinese Medicine， Institute of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]In this study， by the means of the active systemic allergy test in guinea pigs， passive skin allergy test in rats and pseudoallergic test in mice， it was determined that the "allergic reaction" of Shuxuening injection（SXNI） may not be a true IgEmediated allergic reactions， but mainly of pseudoallergic reaction Further pseudoallergic test proved that the pseudoallergic reactions of SXNI had difference between batches and showed dose dependence， so it was recommended to establish SXNI pseudoallergic reaction detection method for timely detecting and controlling the product risk of each batch products In addition， as the pseudoallergic reactions of SXNI were dosedependent， the dose and concentration of SXNI should be strictly controlled in clinical use Then the main pseudoallergenic reaction test was conducted for the main monomer components in SXNI and the different fractions of Ginkgo biloba extract in mice， and the results showed that the sensitizing substances may mainly exist in YXY3 fractions containing flavonol glycosides By further chemically separating YXY3， we got four chemical components Among these four components， YXY31 and YXY32 were testified as the main allergenic components in SXNI through pseudoallergic test in mice To make sure the specific chemical constituent that is responsible for the pseudoallergic reaction， indepth study in followup experiments should be needed

[Key words]Shuxuening injection； allergic reactions； pseudoallergic reactions； pseudoallergenic substances

舒血寧注射液（Shuxuening injection，SXNI） 是银杏叶或银杏叶提取物经加工制成的灭菌水溶液，有效成分是黄酮和内酯，其主要功效为扩张血管，改善微循环，临床上主要用于缺血性心脑血管疾病，冠心病，心绞痛，脑栓塞，脑血管痉挛等疾病[13]。SXNI目前属于内科使用量第一的中药注射剂，国内有9家获批企业生产SXNI，年销售量逾25亿元，使用人次250余万人，SXNI治疗疾病数量也由2010年138个，增加至2011年154个。随着SXNI在临床的广泛使用，其不良反应发生率也呈上升趋势，国家药品不良反应年度监测报告显示在有不良反应报道的中药注射剂中SXNI的不良反应发生率连续3年排名前十（2013—2015年），2016年达到第5，国家食品药品监督管理总局2013年曾根据监测评价结果对舒血宁注射液的说明书进行修订，药品说明书中介绍的不良反应（adverse drug reaction，ADR）临床表现主要为过敏样反应，包括皮肤附件损害（潮红、皮疹，皮下出血，过敏性皮炎等），全身性损害（寒战、高热、疼痛、血管神经性水肿等），呼吸系统损害（呼吸困难、哮喘等），心血管系统损害（心悸、血压下降等），消化系统损害（胃肠道不适、呕吐等），另外还有可能出现精神及神经系统损害等，严重者会出现过敏性休克。当前对于SXNI引发的ADR的主要类型、机制及其中的可能致敏物质还没有明确报道[48]，本研究从过敏反应和类过敏反应两个方面对SXNI注射液诱发的ADR反应进行判别，并对其主要致敏物质进行初步筛选，从而为SXNI的ADR预防及临床安全使用，提高用药安全性提供科学依据。endprint

1材料

11供试品及试剂

SXNI批号150402C2，150403C1，150404C1；银杏提取物YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5，YXY6，YXY31，YXY32，YXY33，YXY34均由国内某药企生产；芦丁（批号20150303）、白果内酯（批号150614）、异鼠李素3O芸香糖苷（批号150126）、白果新酸（批号14092902）、银杏内酯A（批号150514）、银杏内酯B（批号150513）、银杏内酯C（批号150610）、银杏内酯J（批号150614）均购自深圳海瑞特生物科技有限公司；伊文思蓝（Evans blue， EB，国药集团化学试剂有限公司，批号20140228）；5%葡萄糖注射液（山东齐都药业有限公司，批号8B16011903）；甲酰胺（天津光复精细化工研究所，批号20150723）；组胺（国药集团化学试剂有限公司，批号F20111109）；弗氏完全佐剂（Sigma公司，批号SLBH7316V）；弗式不完全佐剂（Sigma公司，批号011M8710）；卵清蛋白（Sigma公司）。

12动物

Hartley豚鼠，体质量350～400 g，Wistar大鼠，体质量220～260 g，BN大鼠，体质量200～240 g，ICR小鼠，體质量23～25 g，均购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）20120001。所有动物于实验前适应性饲养2 d，温度20～23 ℃，相对湿度为40%～70%，12 h明暗周期照明。动物自由饮食饮水，使用由北京市科奥协力饲料有限公司提供的小鼠颗粒饲料，水则为纯净水。

2方法

21SXNI豚鼠主动过敏试验（active anaphylaxis test，ASA）

211剂量设置根据说明书，60 kg成人静脉滴注每日20 mL，则剂量为033 mL·kg-1人，换算成豚鼠等效剂量约为186 mL·kg-1（033×565=186 mL·kg-1），而腹腔致敏体积约为4 mL·kg-1。为了增强舒血宁注射液的致敏性，加入了佐剂和药物混合，即将原液与佐剂按1∶1的比例研磨均匀后对豚鼠进行腹腔注射致敏。

212致敏及激发方法根据指导原则[9]，各组于试验第1， 3， 5天分别进行腹腔注射致敏，对照组腹腔注射5%葡萄糖注射液；佐剂对照组第1天注射弗氏完全佐剂与5%葡萄糖注射液均匀混合液，第3， 5天则注射弗氏不完全佐剂与5%葡萄糖注射液的混合研磨液；SXNI高剂量和低剂量组第1天则腹腔分别注射05，025 mL·mL-1SXNI葡萄糖注射液与弗氏完全佐剂混合研磨液，第3， 5天则腹腔注射上述浓度的SXNI与弗式不完全佐剂混合研磨液。 阳性药组腹腔注射05 mg/只的卵清蛋白（OVA）。末次致敏后14 d和21 d，各组豚鼠1次性静脉激发对应致敏2倍剂量的药物。静脉注射后30 min，详细观察每只动物的反应症状出现和消失的时间。

213结果评价[9] 按表1判断过敏反应发生程度，计算过敏反应发生率。根据过敏反应发生率和发生程度进行综合判断，0（）：过敏反应阴性；1～4症状（+）：过敏反应弱阳性；5～10症状（）：过敏反应阳性；11～19症状（）：过敏反应强阳性；20（）：过敏反应极强阳性。

22SXNI大鼠被动皮肤过敏试验（passive cutaneous anaphylaxis，PCA）

221剂量设置SXNI临床人拟用量为033 mL·kg-1，换算成大鼠等效剂量约为21 mL·kg-1（033×65=21 mL·kg-1），所以本试验选用致敏低剂量组为10 mL·kg-1，致敏高剂量组为20 mL·kg-1（相当于临床剂量）。为了更好的诱发出SXNI致大鼠过敏产生的抗体，将注射液与佐剂按1∶1的比例研磨均匀后对BN大鼠进行腹腔注射致敏，注射体积为4 mL·kg-1。

222试验方法大鼠抗血清制备：致敏首日，加佐剂组将SXNI与弗氏完全佐剂混合均匀对BN大鼠进行腹腔注射，无佐剂致敏组直接腹腔注射舒血宁注射液，阳性药组则腹腔注射卵清蛋白3 mg/只，佐剂对照组注射弗氏完全佐剂与5%葡萄糖注射液研磨的混合液。试验第3天和第5天进行加强致敏：除将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂外，其他试剂配制及注射同首次致敏。末次致敏后第14天进行腹主动脉取血[10%水合氯醛，03 mL·（100 g）-1进行麻醉]，分离血清，进行后续PCA试验。

PCA试验：上述各组抗血清及正常血清用5%葡萄糖注射液稀释成原液，1∶2，1∶4，1∶8 4个浓度。在Wistar大鼠背部预先脱毛的皮内注射各对应组的抗血清01 mL，每只大鼠背上脊柱两侧各注射2个点，共注射4个点。每只大鼠对应1个致敏大鼠血清，4个点分别为不同稀释度的血清，24 h后，各组静脉注射与致敏剂量相同的含06%伊文思蓝的激发抗原（药物终浓度低、高剂量组分别为025，05 mL·mL-1），注射体积为4 mL·kg-1。静脉注射后30 min，处死各组动物，剪取背部皮肤蓝斑，进行蓝斑测定： 1/2蓝斑的长短径之和，并计算蓝斑阳性率。

23不同批号SXNI小鼠类过敏反应评价

231剂量和浓度选择SXNI临床剂量换算成小鼠等效剂量3 mL·kg-1；临床使用时稀释到250～500 mL 5%葡萄糖注射液中进行滴注，则注射浓度为004～008 mL·mL-1。本试验中，选取临床最大浓度的等倍、2倍和4倍作为试验浓度，因为小鼠注射体积为20 mL·kg-1，所以此浓度下注射剂量为16，32，64 mL·kg-1，剂量分别相当于临床剂量的1/2、等倍和2倍剂量。

232类过敏评价方法具体步骤可参见本实验室已建立的小鼠类过敏检测模型[1011]，各组小鼠经尾静脉缓慢推注相应浓度的受试物（阴性对照液、阳性对照液、不同浓度SXNI）与08%EB溶液1∶1混合溶液，给药后30 min，观察动物的一般反应、耳廓蓝染的动物数计算反应率（%）（耳廓蓝染动物数/组内总动物数×100%）；对耳蓝染面积进行评分，见表2。然后，脱颈椎处死小鼠，沿耳根剪下双耳，剪碎，用甲酰胺溶液室温避光浸泡48 h后，用200目钢筛网过滤浸泡液，将滤液加入48孔培养板中，用酶标仪（波长610 nm）检测吸光度。以EB作标准曲线，计算样本中EB含量。endprint

24SXNI不同单体成分类过敏物质筛选研究

241剂量和浓度选择已知SXNI临床剂量换算成小鼠等效剂量为3 mL·kg-1，根据说明书，SXNI中银杏提取物为35 g·L-1，其中含总黄酮醇苷084 g·L-1，而芦丁、异鼠李素3O芸香糖苷均属总黄酮苷类，其中异鼠李素3O芸香糖苷约占

总黄酮苷的22%，所以异鼠李素3O芸香糖苷换算成小鼠等效剂量为055 mg·kg-1（084×022×3）；又连翘酯苷A 006 g·L-1，白果内酯、银杏内酯A～J均属银杏内酯类，均以006 g·L-1为基础值，换算成小鼠等效剂量为018 mg·kg-1（006×3）；白果新酸为银杏酸类，银杏酸为有害物质，其注射液中含量占总含量应小于百万分之一，按百万分之一含量算，则其注射液中小鼠等效剂量为0000 01 mg·kg-1（35×3/106），由于上述物质成分小鼠等效剂量都较低，为了方便操作及最大程度暴露可能的致类过敏作用，本研究将各成分试验剂量设为小鼠等效剂量的2～10倍，白果新酸剂量设为3 000倍以上。

242类过敏检测方法首先称取上述各成分药物溶解后再与08%EB溶液按1∶1等体积混合，分别得到各组注射所需药物的终浓度后，根据各只动物体质量，将上述浓度的受试物药液按照20 mL·kg-1对ICR小鼠进行尾静脉注射。给药后观察30 min内动物的耳廓蓝染情况，记录每组出现耳廓蓝染发生率，耳廓蓝染面积评分方法、耳廓内EB含量检测方法同232。

25银杏叶提取物类过敏物质筛选研究

251提取物制备称取一定银杏提取物，溶于95%乙醇中，先真空抽滤2次，再过微孔滤膜，然后在50 mm工业制备色谱系统，进行4针制备图谱，4针重复性很好，按照图谱分6段接取流分，合并相同流分，进行旋蒸浓缩处理，得到固体样品YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5和YXY6。分析得知，YXY1以内酯化合物为主，银杏内酯A，B，C、白果内酯总质量分数约为42%；YXY3以黄酮醇苷类化合物为主，主要是17个指纹峰化合物，黄酮醇苷类化合物质量分数约为55%；YXY2，YXY4，YXY5和YXY6则主要是杂质。

252剂量设置已知每克银杏提取物中约分离出008 g YXY1，007 g YXY2，017 g YXY3，001 g YXY4，003 g YXY5和0007 g YXY6，而每克提取物可制备286 mL注射液（SNXI中含银杏提取物35 g·L-1），所以小鼠临床等效剂量（3 mL）注射液中约含有YXY1 084 mg（008/286×3×1 000），YXY2 073 mg（007/286×3×1 000），YXY3 178 mg（017/286×3×1 000），YXY4 01 mg（017/286×3×1 000），YXY5 031 mg（003/286×3×1 000），YXY6 007 mg（0007/286×3×1 000）。试验中为了结果的可比性并最大程度暴露各部分可能的类过敏反应，所有提取物均选用相同剂量。

253类过敏检测方法同242项。

26YXY3样品进一步开展类过敏物质研究

由25中试验结果知银杏提取物中YXY3存在致敏物质的可能性较大，所以对YXY3进行化学细分，具体步驟同251，分4段接取流分，得到4个固体样品：YXY31，YXY32，YXY33和YXY34。另外因64 mL·kg-1SXNI能导致小鼠发生明显血管通透性增高反应，所以推算224 mg·kg-1（64×35）及以上剂量时含有致敏物质的银杏叶提取物有诱发小鼠类过敏反应的可能。为了结果的可比性，不同化学成分群均选用相同剂量。类过敏检测方法同242。

27统计学处理

豚鼠主动全身过敏试验和大鼠被动皮肤过敏试验中，各给药组阳性率分别与对照组进行比较，用SPSS 160统计软件进行非参数检验；小鼠类过敏试验中，耳蓝染阳性反应率和耳蓝染率采用卡方检验进行统计，耳廓蓝染面积采用非参数检验，EB渗出量数据用±s表示，用SPSS 160统计软件ANOVA程序进行方差分析。

3结果

31SXNI致豚鼠全身主动过敏试验

对照组和佐剂对照组豚鼠多次致敏再激发后均没有出现明显过敏样反应。由于阳性药卵清蛋白是大分子蛋白物质，致敏后首次激发即发生了明显过敏反应，所有动物均死亡。SXNI不同方式腹腔致敏后，首次激发（末次致敏后14 d），所有致敏组豚鼠均没有出现明显过敏反应症状，而再次激发（末次致敏后21 d），SXNI致敏组多数豚鼠均出现了搔鼻症状（+），数量见表3。另外3个SXNI组各有1只豚鼠出现了咳嗽症状（），以上观察均持续到注射后4 h，上述阳性反应症状约2 h后恢复正常。

32SXNI致大鼠被动皮肤过敏试验

对照组致敏血清没有诱发蓝斑，阳性药卵清蛋白组血清则诱发了明显的蓝斑，并且随着血清浓度增大，蓝斑阳性率和蓝斑面积逐渐增多增大，具有浓度相关性，各SXNI组血清则没有诱发蓝斑产生，见表4。

33不同批号SXNI小鼠类过敏检测

小鼠静脉注射5%葡萄糖注射液后，均未见明显耳廓蓝染；阳性对照组组胺10 mg·kg-1给小鼠静脉注射后，100%的动物均可见以血管通透性增高为表现的明显类过敏反应。各批号SXNI 16 mL·kg-1（临床1/2倍剂量，等倍浓度）均未导致小鼠发生明显耳廓血管通透性增高反应，不引起小鼠类过敏反应；当剂量增加到32 mL·kg-1时，3个批号的SXNI都使小鼠发生血管通透性升高反应；最后当剂量增加到64 mL·kg-1，即相当于临床2倍剂量，4倍浓度时，所有批号的SXNI耳蓝染程度进一步加重，83%以上的小鼠发生耳蓝染，EB渗出量也明显增加。3个批号之间的SXNI诱发的类过敏反应没有明显差异，见图1。endprint

34SXNI中主要成分单体致类过敏反应

小鼠静脉注射5%葡萄糖注射液后，均未见明显耳廓蓝染；阳性对照组组胺10 mg·kg-1给小鼠静脉注射后，100%的动物均可见以血管通透性增高为表现的明显类过敏反应，与对照组相比，EB渗出明显增加（P<001）。

除了白果新酸以外，其他成分均采用临床剂量的10倍作为最高给药剂量，临床剂量的2倍作为低剂量。为了达到充分暴露剂量，白果新酸的高、低剂量给药剂量则分别为临床的6万倍和3 000倍。各受试单体成分药物各剂量即使是最高剂量下均未导致小鼠发生明显肉眼可见的耳廓血管通透性增高反应；但EB渗出量都比对照组增高，且随着各单体成分剂量增加，EB渗出有逐渐增高趋势，见图2。

35SXNI提取物中不同极性物质类过敏反应

根据舒血宁注射液提取这6个流分的得率折算，YXY5和YXY6高剂量组即相当于临床剂量的355（110/031）和1 517（110/007）倍时，均没有诱发小鼠发生明显耳廓蓝染反应，EB渗出量与对照组相比，也没有明显增加；YXY2，YXY3和YXY4各极性成分药物在剂量为21 mg·kg-1时均没有诱发小鼠发生耳廓蓝染反应，当剂量增加到110 mg·kg-1时，YXY2，YXY3和YXY4剂量水平分别相当于各自临床剂量的151（110/073），62（110/178），1 100（110/01）倍时，均诱发100%小鼠发生耳廓蓝染，耳蓝染评分和EB渗出量与对照相比，均明显增加；而YXY1剂量此时相当于临床的131倍（110/084），虽然没有诱发小鼠发生明显的耳蓝染，但其小鼠耳EB渗出量与对照相比也明显增加。综合剂量分析，YXY1，YXY2和YXY4出现类过敏反应的剂量倍数都大于100倍，而只有YXY3的剂量倍数相对较小，由此推测致敏物质可能主要存在于YXY3流分中，见图3。

36SXNI中致类过敏物质进一步研究

由下述结果可知，YXY31和YXY32剂量为448 mg·kg-1，有50%的小鼠发生耳廓蓝染，EB渗出量也比对照组明显升高，二者在224 mg·kg-1剂量水平均未见类过敏反应。已知1 g YXY3约分离出022 g YXY31和025 g YXY32，根据剂量换算，448 mg·kg-1 YXY31和YXY32相当于临床剂量的112倍[448/（022×017）]。YXY33和YXY34即使在较高剂量情况下也未引发小鼠发生明显耳廓蓝染，见图4。

4讨论

本研究结果显示，SXNI在豚鼠主动全身过敏试验中显示有过敏反应弱阳性，但考虑到嚙齿类动物有理毛搔鼻的生活习性，所有暂不排除假阳性的可能，另外在大鼠被动皮肤过敏试验中，大鼠反复致敏条件下并未诱导出IgE产生，提示SXNI的过敏反应可能不是IgE介导的抗原抗体反应。本研究组前期创建了检测药物类过敏反应的新方法——小鼠类过敏反应模型，已经通过很多中药注射剂和西药注射剂试验，证明该模型可以敏感、可靠地检测出注射剂的类过敏反应。本研究中小鼠首次静脉注射SXNI后，可产生明显的类过敏反应，发生迅速，在静脉注射液5～10 min即可出现，约15～20 min基本达到最强，动物反应发生特点与临床反应很相似（在小鼠耳廓肉眼可见到明显的血管通透性增高和血浆外渗症状，这种症状与临床人发生药物过敏时出现的皮疹以及皮肤红肿症状相似）。综合以上结果分析，SXNI的“过敏反应”可能不一定是IgE介导的真正的过敏反应，而是以类过敏反应为主。该模型适用于SXNI的类过敏反应检测，通过血管渗出面积以及渗出物的量可评价类过敏反应的程度。故将来在临床、生产中应重点控制类过敏反应风险。

SXNI的类过敏反应一般在首次用药时即可能发生，与剂量、用药浓度有关。本研究结果也显示，SXNI对小鼠产生的类过敏反应与剂量有密切关系，剂量越高反应程度越强。因此提示临床上应用时应注意用药剂量（包括用药浓度），滴速减慢，不宜加快滴注，在保证疗效的前提下，应尽量降低用药剂量，以降低不良反应发生的风险。不同SXNI的

类过敏反应有一定的批间差异，在本研究中150403C1的反应强于其他2个批号，因此，建议将来在SXNI的生产中，除了要采用化学指纹图谱、含量检测等方法进行质量控制以外，还应该采用生物学方法进行质量控制，例如：建立SXNI类过敏反应检测法，对每批生产的产品进行类过敏反应检测，及时发现并控制产品风险。

根据SXNI的化学物质基础研究结果[1213]，该注射液中的主要单体成分有：芦丁、白果内酯、异鼠李素3O芸香糖苷、白果新酸、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J。为了搞清楚这些单体成分是否可能引起类过敏反应，作者对这些高度纯化的单体成分进行了小鼠类过敏实验并根据这些成分在SXNI中平均含量范围设计每种成分的给药剂量。以往文献推测白果新酸可能为一种致敏成分[1418]，但是该成分在SXNI中含量很低，为了达到充分暴露剂量，白果新酸的高、低剂量给药剂量远高于其他组设定的最大10倍量。研究结果显示，小鼠静脉注射上述各成分后，即使是最高剂量下，各成分均没有诱发小鼠耳廓出现明显的肉眼可见的血管通透性增高症状，渗出评分均判定为阴性。因此，从本实验结果初步判断，以上各单体成分可能不是SXNI致类过敏反应的主要物质基础。

已知舒血宁注射液主要由银杏叶提取物制备，为了探讨SXNI中致类过敏反应的主要组分，所以本研究又从银杏叶提取物入手，YXY1，YXY2，YXY3，YXY4，YXY5，YXY6为银杏提取物中根据色谱图提取的不同流分，采用相同的剂量对以上流分进行了初步筛选，结果显示分别静脉注射高剂量YXY2，YXY3和YXY4后，小鼠发生了不同程度的类过敏反应，并且YXY3在更低的剂量水平就引起了更强的反应，因此初步推测YXY3可能是最主要的致类过敏组分。已知YXY3中含55%黄酮苷类化合物，故类过敏物质可能主要存在于黄酮醇苷类化合物中。由于芦丁、异鼠李素3O芸香糖苷为其中含量较高的黄酮醇苷化合物，本研究中没有发现这2种单体成分诱发小鼠类过敏反应，所以类过敏物质可能是存在于YXY3中的其他黄酮醇苷类物质或其他成分，因此有必要对YXY3流分进行进一步分离研究。随后，作者从YXY3中分离YXY31，YXY32，YXY33，YXY34 4个组分再次进行小鼠类过敏试验，结果表明YXY31和YXY32在相当于临床112倍剂量时均可导致约一半动物发生类过敏反应，YXY31和YXY32可能是舒血宁注射液的致类过敏反应的主要组分，但其中具体化学成分还有待后续试验进行深入筛选研究。endprint

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[责任编辑张宁宁]endprint