不同酸剂诱导人工沉香的分析与评价

周欣 陈丽燕 陈晓东 钟兆健

[摘要]該研究按照《中国药典》（2015年版）要求测定样品醇溶性浸出物含量，同时建立GCMS指纹图谱，使用《中药指纹图谱相似度评价（2012年版）》计算指纹图谱相似度，峰面积归一化法计算170～270 min与0～100 min 2区间总峰面积的比值，自动质谱退卷积定性系统（AMDIS）结合保留指数（RI）鉴定共有组分和差异组分，OPLSDA结合相关系数P（corr）和变量权重（VIP）筛选差异组分，灰色关联度和TOPSIS分析法综合评价人工沉香品质。结果显示18批人工沉香中15批浸出物含量符合要求，指纹图谱相似度在0439～0779，2区间总峰面积比值在0307～13254，共鉴定出9个共有组分和8个差异组分，综合上述20个指标进行灰色关联度和TOPSIS分析得到2%水杨酸诱导的人工沉香品质最优。建立的灰色关联度结合TOPSIS分析法可快速判断不同酸性诱导剂生产的人工沉香品质，为人工沉香的全面质量评价提供参考依据。

[关键词]人工沉香； 酸性诱导剂； 气相质谱； 灰色关联度； TOPSIS

Analysis and evaluation of chemically induced artificial agarwood

ZHOU Xin1， CHEN Liyan 1， CHEN Xiaodong1，3， ZHONG Zhaojian1，

LI Haohua2， ZHANG Weimin2*， GAO Xiaoxia1*

（1. School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China；

2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China， Guangdong Provincial Key Laboratory of

Microbial Culture Collection and Application， Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology， Guangdong Institute of Microbiology， Guangzhou 510070， China；

3. Sirio Pharm Co.， Ltd.， Shantou 515041， China）

[Abstract]In this study，the content of ethanol extraction of agarwood were performed following the method of Chinese Pharmacopoeia（ChP 2015 edition） The chromatographic fingerprints were established by GCMS Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of traditional Chinese medicine（TCM）（version 2012） was employed to calculate the similarity of each chromatogram of agarwood The ratios of sum peak area in the range of 170270 min and 0100 min of individual chromatogram were calculated using square peaks to normalization AMDIS and RI were employed to identify the common and different peaks Correlation coefficient P（corr） combined with Variable important in projection（VIP） value was employed to screen the different representative components based on OPLSDA analysis Grey related degree and TOPSIS were used to evaluate the quality of artificial agarwoods The results showed that more than 100% of the ethanol extract content was found in 15 batches of artificial agarwoods among the total 18 The similarity of 18 batches artificial agarwoods was 04390779 The peak area ratios of two intervals were in the range of 030713254 The 9 common components and 8 different components were identified Meanwhile， 2% salicylic acid is the best inducer based on grey related degree and TOPSIS Grey related degree and TOPSIS can be used to evaluate the quality of artificial agarwoods rapidly These results provide a reference data to evaluate the qualityof artificial agarwoodendprint

[Key words]artificial agarwood； acid inducer； GCMS； grey related degree； TOPSIS

《中国药典》（2015年版）收载的沉香Aqilariae Ligum Resinatum为瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis（Lour） Gilg含树脂的木材[1]。作为“十大广药”之一的沉香药用价值高，亦可用于制造香精油和高档香水[2]，也是极具价值的收藏品。白木香是我国生产沉香的唯一正品植物来源，现已被列为国家珍稀濒危二级保护植物，并载入《中国植物红皮书》[3]。

白木香是典型伤害诱导型植物，健康的白木香树是不产沉香的，只有受到外界伤害时才会诱导白木香树防御性反应从而产生沉香[4]。与健康的白木香相比，沉香化学组成主要是倍半萜类、2（2苯乙基）色酮类衍生物和芳香族类物质[5]，其独特的香气主要来源于倍半萜类化合物。白木香天然结香产量低、需时长，使得沉香长期处于供不应求的状况，为满足市场需求，人们尝试采用多样的人工诱导方式生产沉香。于是砍伤法、凿洞法、钻孔灼烧法等物理伤害诱导法；注射硫酸、甲酸等化学伤害诱导法；接菌法等生物诱导法相继问世[67]。不同人工诱导方法所形成的沉香化学组成差异显著，林峰等[8]采用GCMS分析出3种物理结香法（打钉法、砍伤法和凿洞法）所产沉香均是以倍半萜、芳香族化合物及脂肪酸为主，认为刀砍物理法更接近天然结香方法；陈晓颖等[9]发现人工诱导沉香的2（2苯乙基）色酮类化合物种类较多、含量较高，其中化学试剂刺激法更具有优势；雷胄熙等[10]分析以生物诱导结香技术所产人工沉香可检出大量倍半萜类成分及苄基丙酮，并无检出2（2苯乙基）色酮类成分，而色酮类成分主要为1（苄氧基）8萘酚，表明生物诱导法与传统结香法在结香机制上可能存在差异。

目前，灰色关联度和TOPSIS分析法是应用较广的决策评判方法，灰色关联度分析是构建一个理想参考数列，通过对不同样品和理想品种的关联度进行排序，关联度越大的样品与理想品种越接近，品质越好；TOPSIS分析法则是借助每个样品的各个指标转化为可比较的规范指标，然后比较每个样品的综合性状与理想状态的接近程度，越接近则表现越好[1113]。本文采用化学伤害诱导法进行人工诱导，以不同酸剂作为诱导剂[14]，生产的人工沉香按照《中国药典》（2015年版）规定测定醇溶性浸出物含量，并以天然沉香为参比物构建GCMS指纹图谱，应用灰色关联度和TOPSIS分析法对人工沉香进行综合分析，为酸剂诱导的人工沉香药材的全面质量评价提供参考依据。

1材料

11人工造香试验和样品收集

天然沉香10批（1～10号）由广东省信宜市珍稀沉香发展有限公司提供（来源及收集时间见表1），并由广东药科大学中药学院药用植物教研室严寒静教授鉴定为瑞香科植物白木香A sinensis含有树脂的木材，通过经验鉴别、性状鉴别、理化鉴别以及醇溶性浸出物含量测定和GCMS结合多元统计分析，鉴定为天然沉香[5] 。

人工沉香18批（11～28号）按王磊等[15]专利方法，选取6年生的健康白木香进行诱导试验，白木香树经严寒静教授鉴定为A sinensis。人工造香12个月后，砍伐树干，人工割取含树脂的心材，阴干，制成人工沉香。样品诱导方法、时长、采集时间等详见表1。

12仪器和试剂

GCMS QP 2010 E气相色谱质谱联用仪（日本岛津公司），Rtx5 MS毛细管柱025 μm×025 mm×30 m），BS124S电子分析天平（德国Sartorius），HH6数显电子恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）。

水杨酸购于Aladdin公司（纯度大于995%），乙烯利购于Aladdin公司（純度大于900%），C7～C40正构烷烃（编号DRH008SR2，美国AccuStandard公司，三氯甲烷中500 mg·L-1），三氯甲烷（AR，广州化学试剂厂）。

2方法

21醇溶性浸出物的测定

按《中国药典》（2015年版）一部中沉香[1]醇溶性浸出物测定法进行测定。

22GCMS指纹图谱的建立

221供试品溶液的制备本品粉碎成细粉（4号筛），取细粉约05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷10 mL，密塞，摇匀，称定质量，冷浸过夜。再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液。置70 ℃水浴上蒸干，残渣加三氯甲烷使溶解并转移至1 mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，摇匀，用045 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

222色谱及质谱条件色谱条件采用Rtx5 MS毛细管色谱柱（025 μm×025 mm ×30 m），进样口温度260 ℃，载气为高纯氦气，程序升温（初始温度90 ℃保持4 min，以25 ℃·min-1升至160 ℃，保持5 min，再以03 ℃·min-1升至180 ℃，保持5 min，然后以2 ℃·min-1升至200 ℃，最后以1 ℃·min-1升至230 ℃，保持120 min），流速10 mL·min-1；分流比1/30，进样量为1 μL。

质谱条件电子轰击（EI）离子源；电子能量70 eV，电离电压1 kV，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，溶剂延时5 min，质量扫描范围m/z 50～500。

223方法学考察精密度试验：取11号样品1份，按221项制备供试品溶液，按222项色谱及质谱条件进行GCMS分析，连续进样6次，《中药指纹图谱相似度评价（2012130723版本）》计算相似度均大于0993，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取11号样品6份，分别按221项制备供试品溶液，按222项色谱及质谱条件进行GCMS分析，《中药指纹图谱相似度评价（2012130723版本）》计算相似度均大于0992，表明方法重复性良好。endprint

稳定性试验：取上述同一供试品溶液，分别在0，5，10，15，20 h，按221项色谱及质谱条件进行GCMS分析，《中药指纹图谱相似度评价（2012130723版本）》计算相似度均大于0992，表明供试品溶液在20 h内稳定。

224样品测定对28批沉香样本每批取3份进行测定，取相似度均在0990以上的3个谱图中的1个代表该沉香样本的图谱进行分析。

23数据处理

应用《中药指纹图谱相似度评价（2012年版）》软件处理样品总离子流图，分别构建天然沉香指纹图谱，并以天然沉香生成的对照图谱作为参考图谱，分析人工沉香指纹图谱。

自动质谱退卷积定性系统（automated mass spectral deconvolution and identification system，AMDIS）处理样品的总离子流图，去除噪音和图谱重叠的干扰[1618]，结合NIST05数据库标准质谱信息比对和保留指数（retention indices，RI）校正进行共有组分和差异组分的鉴定。Rgui（310）环境下，XCMS数据包对GCMS数据文件进行反褶积和对齐，以全谱碎片信息为变量导入SIMCAP 120软件中进行全谱碎片信息的有监督模式识别正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）。

醇溶性浸出物含量、指纹图谱相似度、2区间峰面积比值、9组共有成分和8组差异成分相对峰面积，共20个指标进行灰色关联度和TOPSIS分析，寻找到与理想样品最接近的诱导方法；并根据归一化后的原始数据矩阵，确定出不同酸性诱导剂的最佳方案和最差方案，通过求出各被评方案与最佳方案和最差方案之间的距离，最终寻找到最优的酸剂诱导方式。

3结果与分析

31浸出物含量

28批沉香浸出物含量结果见表1，除3批人工沉香外，均符合《中国药典》（2015年版）要求。10批天然沉香的浸出物含量均在100%以上；18批人工沉香中，仅4%水杨酸和4%乙烯利诱导的3批人工沉香浸出物含量低于100%，其余15批浸出物均符合要求。

32GCMS指纹图谱相似度与2区间总峰面积比值分析以及共有组分鉴定

经多点校正后自动匹配，得到10批天然沉香的指纹图谱，见表2，图1A（图中S1～S10与表1中N1～N10相对应），相似度在0821～0888，见表1；以10批天然沉香生成的对照图谱作为参考图谱分析18批人工沉香的指纹图谱，相似度在0439～0779，见图1B，表1；图1C为人工沉香共有峰。

AMDIS结合NIST05数据库和RI鉴定18批人工沉香共有组分，包括倍半萜类3个，色酮类3个和其他类3个，见表2。

前期工作中发现，170～270 min 的总峰面积[主要代表化合物为2（2苯乙基）色酮类]与0～100 min 的总峰面积（主要代表化合物为倍半萜类）的比值[5]可作为判断沉香质量的评价依据，即是说沉香GCMS总离子流图的表观丰度可作为评价沉香质量的指标之一[19]，本文中10批天然沉香2区间峰面积比值均小于1，18批人工沉香的比值在0307～13254，见表1。

33差异组分的鉴定

在Rgui环境下应用XCMS数据包提取10批天然沉香和18批人工沉香的三维数据矩阵，包括样本名称、离子强度和碎片信息（保留时间质荷比），对数据矩阵进行归一化处理后导入SIMCAP 120软件进行OPLSDA判别分析，28批样品被分为3大类，天然沉香为第一类（组1），人工沉香分为2类（组2和组3）。在建立的OPLSDA模型中，在变量X上的总贡献率为838%（R2X=0838），在变量Y上的总贡献率为835%（R2Y=0835），同时交叉验证预测能力为691%[Q2（cum）=0691]，见图2。

由相关系数P（corr）结合变量权重（VIP）值的评价方法来筛选出对OPLSDA分组有贡献的差异组分。P（corr）用于解释各组分对样品分类的贡献大小，VIP>1时变量具有统计学意义。本文选择P（corr）大于08且VIP值大于15的變量为显著性差异组分，共筛选出8个差异组分，鉴定结果见表3。

34灰色关联度分析

灰色关联度中对不同酸剂诱导的18批人工沉香的浸出物含量、指纹图谱相似度、2区间总峰面积比值、9个共有组分和8个差异组分的相对峰面积，共20个指标进行分析，各指标的具体数据见表4。

341理想样品的选择在18个不同酸剂诱导的人工沉香样品中选出各项指标的最优值作为理想样品X，其对应的理想数值按照表4的顺序依次为：3240，0799，078，1325，252，429，683，1023，409，3631，465，831，014，1023，245，907，2130，465，348，442。

342两级最大差和最小差以选出的理想样品指标为基准，根据公式计算人工沉香样品与理想样品序列间的绝对差别，从中得到最大差和最小差分别为3625和0。

minni=1minni=1|x（k）-xi（k）|

maxni=1maxni=1|x（k）-xi（k）|

343关联系数和关联度计算关联系数反应的是各指标与理想值的吻合程度，关联系数越大表明与理想值越接近，计算公式如下。

35TOPSIS分析

351归一化处理上述醇溶性浸出物含量、指纹图谱相似度、2区间总峰面积比值、9组共有组分和8组差异成分，代表了人工沉香成分的主要信息见

4讨论

本文中28批样品浸出物含量基本符合《中国药典》（2015年版）要求；10批天然沉香指纹图谱相似度较高，而18批人工沉香相较天然沉香的相似度偏低且差异较大；同时从指纹图谱的表观丰度来判

断天然沉香2区间总峰面积比值均小于1，而人工沉香的比值则跨度较大，在0307～13254；指纹图谱技术结合多元统计分析，快速筛选出酸性诱导剂生产的人工沉香主要化学组成为白木香醛（baimuxinal，A3）、2（2苯乙基）色酮[2（2phenylethyl）chromone，A7]、绒白乳菇醛（velleral，B2）等沉香特征性成分。endprint

研究表明，水杨酸可促进植物的生长发育，增强植株的防御性反应和抗胁迫能力，提高了植物的产量和营养，同时对植物连作障碍造成的胁迫亦具有一定的积极作用[20]，乙烯利作为外源植物生长调节物质，在农作物生产中也有广泛应用[21]；因此实验选用不同浓度的两种酸剂进行化学诱导，通过综合浸出物含量、指纹图谱相似度、2区间峰面积比值以及9个共有组分和8个差异组分，共20个指标进行灰色关联度和TOPSIS分析，期望优选出最佳的诱导剂，结果显示，尽管排序有差异，但2种分析手段得到F5，F6，F8，F9，G1，G3，H1 7个样品的排名都靠前，其中F5，F6，F8，F9均由2%水杨酸诱导，G1和G3分别由2%和4%乙烯利诱导，尽管G3排名较靠前，但是其浸出物结果却未达到药典要求，H1采用混合诱导剂，操作相对较繁琐。因此分析结果得出，5个采用2%水杨酸诱导的样品综合排名较前，品质较优。

本文通过对白木香木质部注入适量的酸性诱导剂进行化学伤害诱导，可产生沉香树脂，该方法操作简便快速、成本低廉，适用于大规模推广应用。

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[责任编辑丁广治]endprint