异紫堇碱及其类似物的抗癌活性研究

闫倩 李如霞 辛爱一 +柳军玺 李文广

[摘要]采用天然产物化学研究手段，从秃疮花和云南地不容中分离得到部分异紫堇碱类生物碱，并对异紫堇碱进行化学结构修饰得到异紫堇碱类似物，采用MTT法考察了异紫堇碱类似物对3种人癌细胞株的细胞生长抑制活性。结果表明异紫堇碱及其类似物均具有一定的抗癌活性，结合异紫堇碱及其类似物的单晶衍射结构与EGFR分子对接模拟，从立体化学结构、化合物不同取代基位置以及芳香环电子云密度等角度探讨了该类化合物具有抗癌活性的构效关系。

[关键词]阿朴啡类生物碱； 抗癌活性； 构效关系； 异紫堇碱

Research on anticancer activity of isocorydine and its derivatives

YAN Qian1，2， LI Ruxia1，3， XIN Aiyi1，2， LIU Junxi1*， LI Wenguang2， DI Duolong1

（1Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of

Gansu Province， Lanzhou Insititute of Chemical Physics， Chinese Academy of Science， Lanzhou 730000， China；

2 School of Basic Medical Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China；

3 University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

[Abstract]Isocorydine and its analogs were extracted from Dicranostigma leptopodum and Stephania yunnanensis through the method of natural products chemistry Its derivatives were prepared by chemical structure modifications from isocorydine MTT method was used to study the inhibitory effect of those compounds on the growth of HepG2， HeLa and MGC803 cancer cell lines in vitro The results showed that isocorydine and its analogs all have the growth inhibition for those cancer cell lines This paper investigated the structureactivity relationship of isocorydine and its derivatives with anticancer activity in the aspect of stereochemical structure， functional groups positions of the compounds and the electron density of aromatic rings based on the single crystal diffraction structure and the molecular docking of EGFR and isocorydine

[Key words]aporphine alkaloids； anticancer activity； SAR； isocorydine

天然產物是多种重要疾病治疗药物的关键先导化合物[1]，通过考察天然产物的生物学活性与取代基、官能团之间的构效关系，结合药物结构设计对化合物进行结构修饰，提高其活性是新药开发的一条非常重要的途径。阿朴啡类生物碱（aporphine alkaloids）分布于20个科100多属的植物中[2]，是异喹啉类生物碱的一种，为一类重要的植物次生代谢产物。该类生物碱具有多种药理活性，包括抗氧化、抗惊厥、抗痉挛、抗血小板凝聚、细胞毒性等，其中最能引起广泛关注的是此类生物碱具有良好的抗肿瘤活性。

异紫堇碱（isocorydine，音译名：异可利定，国药准字H53021713，属解痉镇痛药）是典型的天然阿朴啡类生物碱，广泛分布于秃疮花Dicranostigma leptopodum（Maxim） Fedde、千金藤Stephania japonica（Thunb） Miers、紫金龙Dactylicapnos scandens（D Don） Hutch、云南地不容S yunnanensis Lo等植物中，研究表明异紫堇碱能够通过诱导G2/M细胞周期阻滞和细胞凋亡，抑制肝细胞癌的增殖，降低CD133+标志干细胞的致瘤能力，具有干细胞靶向性和选择性[3]；联合用药显示异紫堇碱可以增强肝癌细胞株对多柔比星，顺铂等一线抗癌药物的敏感性，起到耐药逆转作用，是一种很有潜力的针对肝癌的化学治疗药物[4]。阿朴啡类的另一重要化合物波尔定能够选择性和剂量依赖性抑制脑胶质瘤细胞系的生长，诱导细胞G2/M期抑制，且对正常细胞没有毒性[5]。

导致肿瘤的发生和发展的一个重要原因是表皮生细胞长因子受体（EGFR）在肿瘤细胞中的过表达和（或）突变[6]，此外，EGFR的异常表达还与新生血管生成、肿瘤的转移、肿瘤的多药耐药等密切相关[7]。以EGFR为靶点进行药物设计与研发成为抗肿瘤药物研发的热点。已有研究表明阿朴啡类生物碱的荷包牡丹碱选择性作用于EGFR超表达的脑胶质瘤细胞系，通过激活BRCA1介导的DNA损伤反应，P53信号通路等发挥抑制肿瘤细胞的生长作用[8]。endprint

本研究从西北特色植物秃疮花和云南道地药材云南地不容中提取分离纯化得到紫堇块茎碱（corytuberine）、stepharine、紫堇碱（corydine）、异紫堇碱、异紫堇块茎碱（isocorytuberine）5种阿朴啡类生物碱。通过结构修饰得到异紫堇二酮（isocorydione）、8氨基异紫堇碱（8aminoisocorydine，NICD），采用MTT考察以上化合物对人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株MGC803的细胞生长抑制活性，通过单晶衍射结构分析、EGFR的分子对接模拟，对抗癌活性的异紫堇碱及其类似物的构效关系进行初步探索，为基于天然阿朴啡类生物碱的高效抗癌活性药物研究提供依据。

1材料

秃疮花采自甘肃省平凉市崇信县，云南地不容采自云南省个旧市，2种植物经兰州大学马志刚教授鉴定，植物标本存放于中科院西北特色植物资源化学重点实验室。人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株MGC803由兰州大学临床前药理研究室提供，本实验室冻存使用；DMEM、RPMI1640培养基、PBS磷酸盐缓冲液、胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、MTT购自Biosharp公司；柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；DMSO分析纯（利安隆博华医药化学有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

Bruker AVANCE HD 400 MHz 超导核磁共振谱仪；Bruker micro TOFQ 高分辨四级杆飞行时间质谱仪；Bruker Smart APEX Xray单晶衍射仪：DF101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（河南巩义市予华仪器责任有限公司）；SWCJ2FD型超净工作台（苏州净化设备有限公司）；HH·CP7W型CO2細胞培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DNM9602G型酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；XD30RFL型倒置显微镜（舜宇光学科技有限公司）；THZ312 台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司）。

2方法与结果

21化合物制备与结构鉴定

211天然生物碱的提取分离参考本实验室研究提取分离纯化生物碱的工艺[9]，从云南地不容中分离得到紫堇块茎碱，stepharine，异紫堇碱，紫堇碱等生物碱。从秃疮花中分离得到异紫堇块茎碱、异紫堇碱、紫堇碱等生物碱。在天然产物化学的研究中发现，秃疮花中含有大量的异紫堇碱（含量大于05%），且已有分离制备工艺[10]，便于工业制备，为结构修饰提供充足的原料。

212异紫堇二酮的制备参照实验室已优化过的合成工艺[11]，采用弗瑞米自由基将异紫堇碱的酚羟基氧化成酮羰基，成功制备异紫堇二酮。取25 g磷酸氢二钠置于圆底烧瓶，加入750 mL蒸馏水，搅拌至完全溶解后加入120 g新鲜制备的弗瑞米自由基，混合均匀，溶液呈紫色，加入50 g异紫堇碱，室温下磁力搅拌，反应12 h，混合液用氯仿萃取（200 mL×3），萃取液干燥，减压蒸馏回收溶剂，残留物以石油醚（60～90 ℃）丙酮（3∶1） 为流动相进行硅胶柱色谱纯化，得紫黑色化合物24 g，得率为49%，见图1。

2138氨基异紫堇碱（NICD）的制备采用苯环活泼氢的硝化加氢还原2步反应，在异紫堇碱的酚羟基对位成功引入氨基，制备8氨基异紫堇碱。取异紫堇碱30 g置于圆底烧瓶中，加入200 mL二氯甲烷搅拌至完全溶解，将烧瓶置于-30 ℃的冷阱中，机械搅拌下缓慢加入由发烟硝酸（074 mL）和浓硫酸（98%，074 mL）组成的硝化试剂。15 h后，将反应混合物倒入冰水中，用氨水碱化至pH 8，减压浓缩回收溶剂，残余物以氯仿甲醇（20

∶1）为流动相进行硅胶柱色谱纯化，得到鲜黄色产物8硝基异紫堇碱18 g，得率为32%。

取10 g上述产物置于高压反应釜，加入400 mL无水乙醇至完全溶解，加入Pd/C氢化催化剂（10%，05 g），高压釜中将氢气压力保持在03 MPa，搅拌2 h。过滤，滤液减压浓缩回收溶剂，残余物以氯仿甲醇（5∶1）为流动相进行硅胶柱色谱纯化，得到棕色无定形粉末07 g，得率为78%，见图2。

22肿瘤细胞生长抑制活性

以Sorafenib为阳性对照品，采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）测试目标化合物对人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人胃癌细胞株MGC803的体外细胞毒性。取对数生长期的测试细胞株悬浮于含10%胎牛血清的培养基中，接种至96孔细胞培养板（3孔重复），过夜贴壁培养。将细胞分为阴性对照组、溶剂对照组、给药组3组。贴壁24 h后，弃完全培养基，加入100 μL不同浓度的待测样品溶液按照浓度梯度依次加入96孔板中，在培养箱中继续孵育24 h。弃去原培养液，每孔加入10 μL 质量浓度为05 g·L-1的MTT工作液，在培养箱中孵育4 h。弃去原培养液，加入100 μL的DMSO，放于摇床低速震荡10 min后，用酶标仪在490 nm波长处测定各孔吸光度（A）。增殖抑制率=（1-A实验/A对照）×100%。采用SPSS 190计算药物对细胞的抑制浓度IC50，重复3次实验，实验结果见表1。

从表1可以看出，异紫堇碱及其类似物对3株肿瘤细胞均具有一定的抑制作用，但其抗癌活性的强弱各个化合物之间存在显著差异，异紫堇碱的抗癌活性与已有的研究结果几乎一致[18]，显示异紫堇碱本身抗癌活性较弱。同样来自天然的阿朴啡类生物碱紫堇块茎碱和紫堇碱的肿瘤细胞生长抑制活性也较差；通过结构衍生产生的异紫堇二酮和NICD具有相对较强的肿瘤细胞生长抑制活性；原阿朴啡类生物碱stepharine的抗癌活性明显比阿朴啡类生物碱的活性强，但相对于通过结构修饰产生的衍生物，其抗癌活性较弱。以上研究结果表明通过化学结构修饰提高异紫堇碱类化合物的抗癌活性空间很大。endprint

23立体化学结构

为充分理解该类化合物的立体空间化学结构，本研究通过不同的培养条件，生长了相关化合物的单晶用于XRay衍射分析，见图3。

通过化合物单晶衍射结构分析，发现阿朴啡类化合物的基本结构母核中含有A环和D环为联苯型四元环结构组成，A环和D环2个芳香环组成的二面角在30～40 °，见表2，由于B环和C环的存在、牵制和四元环结构的限制，使得A环和D环几乎共平面，化合物整体具有较强的刚性，原子自由旋转和振动的空间有限，含氮的杂环（B环）和C环没有不饱和键存在，部分化学键单键自由旋转，降低自由能形成半椅式结构，使得C6位的立体构型均为S构型。异紫堇二酮由于结构中D环酚羟基的氧化和C6a与C7位脱氢形成A，C和D环的超共轭体系，化合物结构更加稳定，A环和D环的二面角在15～30 °。Stepharine为原阿朴啡类生物碱，C环形成五元环，在C7a位与D环形成螺环结构，A环和D环的二面角在80～100 °，几乎互相垂直，化合物分子结构整体比较稳定，自由能比较低。本研究中所选阿朴啡类生物碱的取代基主要以甲氧基和羟基取代为主，不同的化合物在C1，C2，C10和11位具有不同的甲氧基或羟基取代。但这些不同位置的取代基由于空间位阻、氢键形成以及空间范德华力的不同对于化合物整体的稳定性，电子云密度以及化合物物化常数产生显著的影响。紫堇块茎碱中C1位和C11位均为羟基，存在电子云的空间相斥作用，不易形成氢键，紫堇碱分子中D环中的2个甲氧基取代和C8位对位氢原子的存在，增加了芳香化的电子云密度，见表2。

24分子对接

分子对接采用SurflexDock受体配体对接自动软件，以EGFR受体和伊洛替尼的复合体（PDB code： 1M17）为目标配体和受体理想构型，在ATP络氨酸激酶竞争性结合口袋中剔除伊洛替尼的蛋白理想构象，将异紫堇碱衍生物接入到ATP结合口袋底部，自由旋转配体分子，搜索优势构象和最佳结合位点，结合静电势表面图，三维等高线图，探索异紫堇碱及其类似物与关键络氨酸激酶受体表皮生长因子受体（EGFR）的立体空间结合情况及匹配度，见图4。

对接结果显示异紫堇碱的得分常数为-09，异紫堇二酮为592，NICD的得分为475，这与异紫堇二酮、NICD、异紫堇碱的体外抗肿瘤活性数据相一致，表明通过化学结构修饰可以提高该类化合物与EGFR的结合度，对接分析中发现，C8位引入羰基和氨基后，可以和EGFR的相应氨基酸形成氢键，增强其对于EGFR的结合度，但相对于经典的EGFR靶向药物吉非替尼等，其结合常数相对较低（8～10）。

25构效关系分析

异紫堇碱类生物碱具有一定的抗癌活性，鉴于其分子结构中固有的联苯型共平面的四元环结构所固有的刚性分子结构，该类化合物的抗癌活性与其取代基的种类和位置具有一定的关系[19]，同分异构体的紫堇块茎碱和异紫堇块茎碱，都含有2个羟基和2个甲氧基取代，后者的抗癌活性强于前者3倍以上，原因在于紫堇块茎碱2个羟基的空间位置较近，互相排斥致使分子静电势显著降低，化合物的溶解度显著降低，致使紫堇块茎碱的抗癌活性较弱。异紫堇块茎碱中的D环中酚羥基的存在有效降低了芳香环的电子云密度，相应增加了分子的静电势。2个羟基在分子识别和分子对接中形成氢键作用，有助于增强其抗癌活性。同属同分异构体的紫堇碱和异紫堇碱，由于分子中只含有1个羟基，虽然对于化合物静电势和溶解性等理化常数的影响也比较大，但整体对于抗癌活性的影响并不大。异紫堇碱类生物碱的C8位化学结构修饰对于化合物抗癌活性的提高是非常关键的。不同于异紫堇碱母体结构的原阿朴啡类生物碱具有较好的抗癌活性，与其形成的螺环结构具有紧密关系。N甲基对于阿朴啡类和原阿朴啡类生物碱的抗癌活性影响并不是关键因素。

3讨论

阿朴啡类生物碱广泛分布于多种植物中，具有多种药理活性，是一类重要的植物次生代谢产物，但其临床应用有限，为开发该类化合物的临床价值，鉴于通过化学结构修饰可以显著提高该类化合物的抗癌活性，有必要对该类化合物的抗癌活性及其构效关系进行深入研究，通过进一步的结构优化，发展抗癌活性化合物。

天然产物在植物长期的进化过程中要与外界生物进行生存竞争，其显性遗传的积累使得化合物趋于稳定，天然产物是一个相对平衡、化学结构稳定的有机体，一旦打破这种平衡，就会产生意想不到的效果。本研究表明，化学结构修饰可以显著提高该类化合物的抗癌活性，尤其C8位的化学结构衍生。

对阿朴啡类生物碱进行进一步的化学结构优化和抗癌活性筛选研究，预期可以发现活性较好的抗癌药物，为天然阿朴啡类生物碱的有效利用提供依据。

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[責任编辑丁广治]endprint