衰老的分子调控机制及中药的干预作用

刘不悔 顾一煌 涂玥 何伟明 吴薇 刘莹露 万子玥 万毅刚����

[摘要]衰老（aging）是生物體组织、器官以及细胞功能随时间而逐渐丧失的渐进过程。有关衰老分子机制的学说包括经典的“端粒（telomere）学说”、“氧自由基（oxygen radical）学说”、“非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation）学说”等，还有新近提出的“DNA甲基化（DNA methylation）学说”、“线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）学说”、“自噬（autophagy）学说”等。最新的研究表明，自噬是造血干细胞对抗衰老的一种有效措施。近年来，基于衰老的分子调控机制而发现了一些很有前途的抗衰老药物，如烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）和抗衰老肽——FOXO4DRI。此外，在植物提取物领域中也有很多新发现，其中，以姜黄素（curcumin）、白藜芦醇（resveratrol）为代表的中药提取物以及一些单味中药、经典的中药复方可以在体内外干预人类衰老的分子调控机制而发挥一定的抗衰老作用。总之，基于衰老分子调控机制而研制或发掘抗衰老药物，尤其是天然药物，这是抗衰老研究领域的主要发展方向之一。

[关键词]衰老；中药；抗衰老；分子机制；自噬

Molecular regulative mechanisms of aging and interventional

effects of Chinese herbal medicine

LIU Buhui1， GU Yihuang2， TU Yue2*， HE Weiming1*，

WU Wei3， LIU Yinglu3， WAN Ziyue4， WAN Yigang5

（1. Department of Nephrology， The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China；

2. Department of Traditional Chinese Medicine Health Preservation， Second Clinic Medical School，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

3. Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Chinese Medicine and Western Medicine，

Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210008， China；

4. Department of Social Work， Meiji Gakuin University， Tokyo 1088636， Japan；

5. Department of Traditional Chinese Medicine， Nanjing Drum Tower Hospital， The Affiliated Hospital of Nanjing

University Medical School， Nanjing 210008， China）

[Abstract]Aging is a gradual process during the loss of functions in cells，organs and tissues by time The molecular mechanisms of agingrelated theories include the classical ones such as telomere，oxygen radical and nonenzymatic glycosylation，as well as the newly proposed ones such as DNA methylation，mitochondrial DNA （mtDNA）and autophagy The latest study showed the antiaging effect of autophagy in hematopoietic stem cells In recent years，based on the molecular regulative mechanisms of aging，a number of the promising antiaging drugs have been found，including nicotinamide mononucleotide（NMN）and FOXO4DRI，a peptide of antiaging In addition，there are many new discoveries in the field of plant extracts，in which，the extracts from Chinese herbal medicine（CHM），some single CHMs and the classical prescriptions of CHM，represented by curcumin and resveratrol，have the partial antiaging effects by regulating the molecular mechanisms of aging both in vivo and in vitro In brief，developing or exploring antiaging drugs，especially the natural drugs，is one of the main development directions in the field of antiaging research in the basis of the molecular regulative mechanisms of aging.endprint

[Key words]aging； Chinese herbal medicine； antiaging； molecular mechanism； autophagy

目前，随着全球人口的不断增长，人口老龄化已经成为严重的社会问题，因此，在当今的人类生活和科学研究中，“衰老（aging）和抗衰老（antiaging）”是各个研究领域关注的热点和焦点[13]。衰老是生物体组织、器官以及细胞功能随时间而逐渐丧失的渐进过程。纵观近一个世纪的衰老和抗衰老研究历程，期间，产生了许多有关衰老分子机制的学说（或假说），其中，包括经典的“端粒学说”、“氧自由基学说”、“非酶糖基化学说”等，还有新近提出的“DNA甲基化学说”、“线粒体DNA学说”、“自噬学说”等（图1）[4]。近年来，随着细胞、分子生物学实验技术的不断进步，对于衰老的分子調控机制，取得了较为深刻的认识[56]。2017年的最新研究表明，胞内甲基转移酶SETD8酶可以有效地调节人胚肺成纤维细胞的衰老过程[7]；通过无义介导的mRNA降解而进行RNA质量控制可以明显延长秀丽隐杆线虫的寿命[8]。更为重要的是，国外学者基于衰老的相关分子机制而发现了一些很有前途的抗衰老药物。例如，美国Harvard大学医学院的著名学者Sinclair教授团队发现了改善 DNA 修复的革命性抗衰老药物——烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN），其作用机制与sirtuins（SIRT17）激活有关[1]；荷兰Erasmus大学医学中心Baar等报道[2]，“抗衰老肽——FOXO4DRI”能选择性地找到并摧毁衰老细胞，其机制是阻断了衰老相关蛋白FOXO4与P53之间的相互作用。无疑，这些成果使抗衰老化学药物的研制成为了可能。此外，在植物提取物领域也有很多新发现。以姜黄素（curcumin）[911]、白藜芦醇（resveratrol）[1213]为代表，国内外学者在中药提取物、单味中药以及经典的中药复方中找到了一些延年益寿的药物，这些“天然药物”可以在体内外干预人类衰老的分子调控机制而发挥一定的抗衰老作用。

1端粒学说与衰老以及中药的干预作用

1938年，英国Edinburgh大学Muller首先发现了端粒（telomere）。它是位于染色体末端的DNA蛋白质复合体，由端粒DNA序列和端粒蛋白构成，其功能是控制细胞分裂周期而维持染色体的完整性[14]。端粒自身也有寿命，细胞每分裂一次，端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂而死亡[15]。端粒酶（telomerase）是一种由催化蛋白和RNA模板组成的酶，可合成染色体末端的DNA，

决定端粒的长度[16]。研究表明，端粒缩短和端粒酶活性低下是导致衰老的主要驱动因素之一[17]。2017年，美国斯克里普斯研究所的学者发现了一种不同于端粒酶的新型蛋白质——端粒锌指相关蛋白（telomeric zinc fingerassociated protein，TZAP），它也能够结合在染色体末端而决定端粒的长度，与衰老的发生密切相关[18]。

端粒学说相关的抗衰老中药包括锁阳、当归以及由人参、何首乌等中药组成的中药复方制剂。马丽杰等观察锁阳提取物——锁阳多糖（Cynomorium songaricum polysaccharide，CSP）对老年小鼠血液和脑组织端粒长度的影响。作者每天给昆明小鼠腹腔注射D半乳糖（500 mg·kg-1）建立衰老模型，以不同剂量CSP（20，40，80 mg·kg-1）灌胃，干预56 d后，采用实时荧光定量PCR测定模型鼠外周血端粒的平均长度；结果显示，高剂量CSP组（80 mg·kg-1）小鼠外周血T（telomeres）/S（single copy gene）比值显著高于模型组，此外，高、中、低剂量CSP组小鼠脑组织中T/S值也明显高于模型组；作者推测，CSP在体内能够延长衰老模型鼠外周血和脑组织端粒长度，延缓衰老[19]。Zhang等为了探讨当归提取物——当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide，ASP）调控造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）衰老的潜在机制而在体内观察HSCs端粒长度、端粒酶活性以及衰老相关的P53蛋白表达的改变情况。作者将C57BL/6J小鼠随机分为青年组、老年组和药物干预组；老年组小鼠通过X射线照射而建立小鼠HSCs衰老模型，药物干预组小鼠在X线照射期间经灌胃给予ASP（200 mg·kg-1），青年组小鼠经灌胃给予生理盐水；结果显示，与青年组相比，老年组小鼠G1期HSCs细胞比例显著增加，β半乳糖苷酶染色阳性细胞率和P53蛋白表达水平明显增高，端粒长度和端粒酶活性降低；与老年组小鼠相比，药物干预组G1期HSCs细胞比例下降，P53蛋白表达水平下调，端粒长度和端粒酶活性增加。作者推测，ASP可以拮抗X射线诱导的HSCs衰老，其作用是通过延长端粒长度，增加端粒酶活性，下调P53蛋白表达水平而实现的[20]。此外，Yu等报道[21]，由人参、何首乌、杏仁、青皮、厚朴、乳香等中药组成的天升元口服液1不仅可以增强正常外周血单核细胞和CD34+造血干细胞端粒酶的活性，而且，能够降低前髓细胞性白血病细胞系HL60细胞端粒酶的活性，其作用呈剂量依赖性；经β半乳糖苷酶染色证实，天升元口服液1调节端粒酶活性的作用与其拮抗细胞衰老密切相关。

2氧自由基学说与衰老以及中药的干预作用

在氧化损伤过程中，自由基的不完全还原可以产生多种活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括过氧化氢（H2O2）、阴离子自由基超氧化物、羟基自由基以及线粒体中的电子传递链等[22]。在机体诸多非吞噬细胞中，有一系列烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶催化亚基gp91phox的同源物，统称为非吞噬细胞NADPH 氧化酶（nonphagocytelike NADPH oxidase，Nox）蛋白家族。Nox和5脂氧合酶是细胞中ROS的主要来源，ROS通过降解不饱和脂质而形成丙二醛（malondialdehyde，MDA），它作为生物体内氧化损伤的标志物，其含量随细胞衰老而持续增加[23]。基于这些认识，早在1956年，Harman等根据射线损伤存在氧自由基（oxygen radical）增加的现象而提出衰老的氧自由基假说[24]。然而，由于临床上缺乏明确的抗氧化而延缓衰老的证据，这一假说至今也没有得到公认。晚近的研究表明，生物体内源性抗氧化系统的公共底物——NADPH氧化酶是抗氧化反应中起关键作用的分子，而葡萄糖6磷酸脱氢酶（glucose6phosphate dehydrogenase，G6PD）是细胞内合成NADPH氧化酶的关键酶。目前，可以利用转基因手段促使小鼠在体内大量表达G6PD，提高细胞内NADPH氧化酶含量，从而，增强细胞的自然抗氧化损伤能力，延缓衰老[25]。国内外学者认为，这项研究有力地支持了上述的氧自由基衰老学说。一般来说，抗氧化剂可通过抑制ROS的产生，或者清除已产生的ROS来发挥抗氧化作用，但是，大多数具有抗氧化作用的物质在浓度或条件改变后会诱发促氧化反应。endprint

氧自由基学说相关的抗衰老中药包括枸杞子和著名经方六味地黄丸。Qi等观察枸杞子提取物——枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBPs）对氧化损伤诱导人类晶状体上皮细胞衰老与凋亡的影响。作者用200 μmol·L-1H2O2刺激SRA01/04细胞（人晶状体上皮细胞系），而后，将这些细胞随机分为对照组与干预组，干预组给予LBPs处理；结果表明，LBPs不仅能显著降低H2O2诱导的细胞凋亡、ROS累积、线粒体膜电位丢失以及MDA含量，还能改善H2O2诱导的Bcl2和Bax蛋白表达水平，并且，提高抗氧化酶的活性。此外，LBPs还能延缓H2O2诱导的细胞衰老[26]。Tseng等研究六味地黄丸对帕金森（Parkinson′s disease，PD）神經元退行性病变和凋亡的影响。作者用100 μmol·L-11甲基4苯基吡啶（1methyl4phenylpyridinium，MPP+）干预原代中脑神经元48 h而诱导其发生退行性病变，而后，将神经元分为对照组和干预组，用不同剂量的六味地黄丸水煎液（001，01，1，10 mg·L-1）预处理干预组神经元1 h；结果显示，六味地黄丸水煎液不仅能减少MPP+诱导的ROS产生，上调NADPH氧化酶的表达，增强神经元的抗氧化能力，还能提高线粒体膜电位，调节凋亡相关蛋白Bcl2，Bax，细胞色素C和cleavedcaspase3的表达。作者认为，六味地黄丸在体外可以改善PD神经元退行性病变[27]。

3非酶糖基化学说与衰老以及中药的干预作用

非酶糖基化（nonenzymatic glycosylation，NEG）是以还原糖和生物大分子（蛋白质、脂质、核酸）为核心反应物的一类生化反应，不需要酶催化，最终会形成晚期糖基化终产物（advanced glycation endproducts，AGEs）[28]。研究表明，AGEs可与生物大分子结合而形成脂褐质（老年斑），还可与胶原弹力蛋白等结合而使富含结缔组织的皮肤、肌腱和血管失去弹性，出现老化[29]。此外，AGEs在体内通过其受体（receptor of AGE，RAGE）依赖途径影响NADPH氧化酶和其他的胞内信号转导通路，促进氧自由基生成，加速衰老[30]。

非酶糖基化学说相关的抗衰老中药包括红景天以及由人参、三七、川芎等组成的中药复方制剂。Mao等观察红景天提取物——红景天苷（salidroside）对D半乳糖诱导的小鼠衰老模型的抑制作用。作者选用5月龄C57BL/6J小鼠，随机分为4组（对照组、D半乳糖组、D半乳糖联合红景天苷组以及红景天苷组），经药物干预8周后，其结果显示，对于D半乳糖诱导的衰老模型鼠，红景天苷能够有效地抑制血清AGEs含量，逆转神经系统的衰老性改变，增强淋巴细胞的有丝分裂，提高白细胞介素2（interleukin，IL2）水平；此外，红景天苷还能明显下调衰老模型鼠大脑皮质中胶质纤维酸性蛋白、神经营养因子3蛋白表达水平。作者认为，红景天苷在体内能够抑制AGEs而拮抗D半乳糖诱导的神经系统衰老[31]。雷燕等探讨老年小鼠的血管老化特征以及人参、三七和川芎提取物的联合干预作用。作者选择自然衰老模型鼠，用维生素E和不同剂量的中药混合提取物进行干预；结果显示，对于自然衰老模型鼠，高、中、低剂量的中药混合提取物均能减少血管组织中AGEs和ROS的含量，而高剂量中药混合提取物能明显减轻血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖，降低血管组织中胶原纤维的含量，改善血管老化[32]。

4DNA甲基化与衰老以及中药的干预作用

所谓DNA甲基化（DNA methylation）就是指在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上而形成5甲基胞嘧啶（5methylcytosine，5mC）的过程[33]。研究表明，在衰老细胞中，5mC总含量降低，这种去甲基化有可能引起染色体的不稳定和重排，并且，使细胞出现衰老表型[34]。因此，DNA甲基化被认为是细胞衰老的主要特征之一。Hannum等收集年龄在19～101岁的656位健康人的血液样本而检测其DNA甲基化标志；结果显示，健康人群的DNA甲基化会随年龄增长而发生改变，同时，还会受到性别和基因组遗传变异的影响，DNA甲基化能够显示不同个体衰老的快慢程度和不同器官的老化速度[35]。

DNA甲基化学说相关的抗衰老中药包括著名经方左归丸和人参汤。龚张斌等选用90只正常大鼠，建立自然衰老模型，观察左归丸对模型鼠衰老以及外周血T细胞DNA甲基化的影响。作者将模型鼠随机分为青年对照组、老年对照组以及老年左归组（各30只），从各组大鼠外周血中提取CD4+细胞，并接受抗CD3抗体和抗CD28抗体的共同干预（24 h），检测IL2 核酸（mRNA）表达水平、DNA甲基转移酶水平以及IL2基因启动子区G位点甲基化水平；结果显示，左归丸有延缓老年大鼠外周血CD4+细胞衰老的作用，其机制与增强CD4+细胞活性，降低DNA甲基转移酶水平，抑制IL2基因SET1区域甲基化水平有关[36]。陈比特等观察人参汤联合茶多酚（绿茶提取物）的抗衰老作用。作者首先用茶多酚联合人参汤干预老年小鼠，并且，分别与青年小鼠和接受安慰剂的老年小鼠做对照；其次，检测各组小鼠肝细胞DNA甲基化转移酶，并评估其活性；结果表明，对于特定浓度的茶多酚联合人参汤干预的小鼠，其肝细胞DNA甲基化转移酶水平及活性明显增强。作者推测，特定浓度的茶多酚联合人参汤可以延缓肝细胞衰老[37]。

5线粒体DNA与衰老以及中药的干预作用

线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是唯一的核外遗传物质，当它暴露于高ROS环境中，可致其突变和缺失而引起线粒体类疾病或衰老[38]，这可能与其在氧化微环境中保护性组蛋白修饰丢失而影响核内DNA修复机制有关[39]。借助去除线粒体DNA聚合酶γ的小鼠，mtDNA损伤引起的过早老化和寿命缩短现象被相继确认。近年来，在衰老相关的神经和运动障碍性疾病领域，mtDNA 异质性（突变型mtDNA与野生型 mtDNA 共存的现象）作为简单而无创的衰老预测因子得到广泛关注[40]。endprint

线粒体DNA学说相关的抗衰老中药包括著名经方五子衍宗丸和松花粉。王学美等观察五子衍宗丸对老年大鼠mtDNA缺失和线粒体复合酶活力的影响；作者发现，对于自然衰老的老年大鼠（22月龄），高剂量的五子衍宗丸悬浊液可减少脑组织mtDNA缺失，提高线粒体呼吸链复合酶活性，延缓脑组织衰老[41]。喻陆等研究松花粉对老年小鼠肾组织mtDNA缺失和突变的影响；作者将昆明老年小鼠随机分为松花粉组、老年对照组和年轻对照组；松花粉组小鼠每天经灌胃给予松花粉（750 mg·kg-1），年轻对照组和老年对照组小鼠经灌胃给予生理盐水；干预60 d后，检测模型鼠肾组织内mtDNA缺失、突变情况以及MDA含量；结果显示，老年对照组小鼠肾组织内mtDNA表达和缺失水平明显升高；与老年对照组相比，松花粉组小鼠肾组织mtDNA缺失较少，MDA含量明显降低。作者认为，松花粉能够抑制老年小鼠肾组织mtDNA缺失和突变，这可能是其拮抗肾脏衰老的机制之一[42]。

6自噬学说以及中药的干预作用

自噬（autophagy）是细胞对抗恶劣环境的重要手段。在营养缺乏或高温氧化等恶劣环境下，细胞可以启动自噬而达到保护自身的目的[43]。2017年的最新研究显示，自噬也是许多物种对抗衰老的一种有效措施。Ho等发现，造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）失去自噬作用会出现明显的老化现象，包括胞内线粒体累积的增加、代谢水平的升高以及细胞自身更新和再生能力的降低等[44]。对于包括干细胞在内的各种细胞而言，新陈代谢率降低是其衰老的共性特征，代谢废物无法在胞中得到及时清除，必将损伤细胞功能，降低細胞活性，缩短细胞寿命；而自噬可以及时降解受损的蛋白质，清除胞内废物，维护细胞功能，延长细胞寿命[45]。因此，自噬可以调控细胞衰老。在这一调控过程中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）及其相关信号途径发挥了重要作用，其中，涉及腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）/mTOR通路[46]、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）/丝氨酸苏氨酸激酶（serinethreonine kinase，Akt）/mTOR通路[47]、AMPK/沉默信息调节因子1（silent information regulation 1，Sirt1）通路[48]以及转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）/Smad通路[4950]等。研究显示，调控这些信号途径的关键信号分子就可以抗衰老（图2）。

自噬学说相关的抗衰老中药包括虎杖、姜黄以及冬虫夏草等。Zhang等报道[5152]，肾小球系膜细胞在高浓度葡萄糖（30 mmol·L-1）刺激96 h后，其Sirt1活性受到显著抑制，干扰自噬过程，诱导细胞衰老；经1 mg·L-1白藜芦醇干预后，Sirt1活性显著提高，细胞衰老得到明显改善。李春花等人采用腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导糖尿病大鼠衰老模型，每日用白藜芦醇（20 mg·kg-1）给模型鼠灌胃，连续干预12周；作者发现，自噬相关蛋白Ⅱ型LC3以及Beclin1表达明显上调，模型鼠脏器衰老明显好转[53]。Gu等报道[54]，在注射阿霉素肾病大鼠模型中，AMPK活性降低，肾脏细胞凋亡，肾脏衰老；给予白藜芦醇干预后，AMPK/mTOR信号通路激活，细胞自噬蛋白表达增加，细胞凋亡改善，肾脏衰老好转。Xu等发现，经H2O2刺激后的肾小球系膜细胞，在姜黄素干预后，其自噬标志性蛋白Ⅱ型LC3表达明显增加，肾脏病理性损伤和衰老指标显著改善[55]。此外，对于糖尿病肾病患者而言，由肾脏分泌的抗衰老激素——分泌性Klotho蛋白能够抑制机体衰老，并保护心血管、肾脏等系统的功能。黄可等报道[56]，STZ诱导的糖尿病大鼠模型，其肾组织内Klotho蛋白表达明显下降，经冬虫夏草灌胃干预24周后，肾组织Klotho蛋白表达呈上升趋势，机体和肾脏衰老得到延缓。

综上所述，有关衰老分子机制的学说包括“端粒学说”、“氧自由基学说”、“非酶糖基化学说”、“DNA甲基化学说”、“线粒体DNA学说”以及“自噬学说”等，令人遗憾的是，迄今为止，还没有一个学说可以全面而准确地解释衰老及其相关的分子机制。近年来，对于衰老分子调控机制的认识取得了长足的进步，但是，基于人类在日常生活中对于抗衰老的需求，在临床上找到有效的生物标志物来帮助确定复杂的衰老过程并进行有效的干预，这一点更为重要。研究表明，经典的衰老标志物包括血液中的脂质、多肽和激素等；新近发现的衰老标志物包括microRNA、胆红素和AGEs等[6]。对于这些简单而明了的衰老标志物，其临床价值如何评估？它们与已知的衰老分子机制是否有明确的相关性？在临床上或日常生活中，是否能借助药物或保健品，尤其是抗衰老的植物提取物而进行有效地干预或调控呢？笔者认为，这是抗衰老研究领域亟待解决的问题，也是其今后的发展方向之一。众所周知，抗衰老属于中医养生学范畴。明代的著名医家虞抟在《医学正传》中指出：“肾气盛则寿延，肾气衰则寿夭”。因此，自古以来“补肾固精”就是中医养生（抗衰老）的根本大法。笔者相信，相比于白藜芦醇、姜黄素等中药提取物，具有补肾固精等功效的单味中药（冬虫夏草等）和经典的中药复方（六味地黄丸、五子衍宗丸等）应该有更好的抗衰老作用。此外，笔者认为，衰老不仅源于“肾虚”，还与“瘀血”等病理产物密切相关。“祛瘀生新”也是中医抗衰老的重要治法之一。笔者发现，“祛瘀生新”代表性中药大黄及其有效单体成分大黄酸能减轻D半乳糖诱导的肾小管上皮细胞衰老，其分子机制可能与肾脏自噬信号通路[5758]有关。

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