成都市区污染空气中PM2.5对大鼠学习记忆能力的影响*

张霄龙 任杰 王正荣△ 应正祺 王霞 黄禹瑶 后望 成姝婷

(1.四川大学华西基础医学与法医学院；2.四川大学华西临床医学院； 3.四川大学华西口腔医学院，四川 成都 610041)

成都市区污染空气中PM2.5对大鼠学习记忆能力的影响*

张霄龙1任杰1王正荣1△应正祺1王霞2黄禹瑶3后望1成姝婷1

(1.四川大学华西基础医学与法医学院；2.四川大学华西临床医学院； 3.四川大学华西口腔医学院，四川 成都 610041)

目的：研究成都地区污染空气中PM2.5微粒对大鼠学习记忆能力的影响。方法：Morris水迷宫筛选后的雄性SD大鼠32只，随机分为：对照组、PM2.5低剂量组、PM2.5中剂量组、PM2.5高剂量组(n=8)。用EM-2062A颗粒物采样器采集2016年7月14日至7月30日成都市区污染严重区域空气中的PM2.5微粒，制成混悬液后对大鼠进行气管滴注染毒处理，低、中、高剂量组PM2.5混悬液分别为0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、和15.36 mg·kg-1，3周后以水迷宫实验对比其学习记忆能力，ELISA检测其肺组织IL-1β的水平。结果：与对照组相比，染毒大鼠的逃避潜伏期均有所增加，且高剂量组增加最多(P<0.05)，而有效区域运动时间长度则与染毒剂量呈反比。结论：成都地区污染空气中PM2.5微粒能够损害大鼠的学习记忆能力，这种损害与PM2.5微粒的浓度有关。

成都；PM2.5；大鼠；学习记忆能力

空气污染一直是危害人类健康的重要因素之一，空气污染物中的PM2.5因其粒径小、表面积大、活性强、易吸附有毒有害物质等而危害更甚。雾霾天气的加剧引起了人们的研究兴趣，从1999年起，国内便开始有研究雾霾的主要污染物PM2.5的相关文献[1]，并于2011年起爆发研究热潮。成都的空气质量问题在近年来越来越严峻，其污染物与呼吸系统疾病的关联也受到了广泛的关注。从文献中，我们可以了解到，PM2.5可以对大鼠的呼吸循环系统造成氧化损伤[2]。能够刺激免疫系统，诱发炎症反应[3]。可以促使大鼠凝血，造成小血管栓塞[4]。还可以攻击大鼠体细胞DNA，造成核酸损伤[5]。空气污染的加剧是否在其他方面对人类的健康造成影响，这是值得我们特别关注的方面，特别是近年来中小学频繁出现在PM2.5空气质量指数较高时宣布停课的情况，那么空气污染是否会对生物体的学习记忆能力造成影响成为了我们的关注重点。

有研究者通过流行病学调研统计居住在不同污染程度地区成年人的健康状况而得出了PM2.5会影响人类的学习记忆的结论[6]。但直接的实验研究则尚未见有报道。然而，从流行病学角度的研究存在诸多偏倚，可能出现个体差异大、污染物侵袭程度不一、人口迁移等诸多问题。其数据虽然直接来源于人，但可能存在较大误差。因此，有必要在严格的实验条件下进行动物实验，验证PM2.5对实验动物学习记忆的影响以及产生这种影响的原因。目前已有关于PM2.5影响大鼠海马中铅铝锰含量及神经递质的研究[7]，但尚没有关于PM2.5对大鼠学习记忆影响的报道，也没有关于PM2.5染毒大鼠的迷宫行为学实验。

本研究采集成都污染区域空气中的PM2.5微粒来对大鼠进行染毒处理，通过Morris水迷宫实验对不同染毒剂量大鼠的空间学习记忆能力进行评估，并检测其肺组织中白介素-1β的水平，以研究染毒剂量的PM2.5是否会对大鼠肺部造成炎症影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级雄性SD大鼠(200～220g)40只，由四川省人民医院实验动物研究所提供。所有大鼠均自由进食和饮水，待饲养1 周后开始实验。

1.2 实验仪器与实验试剂

EM-2062A颗粒物采样器(国技仪器，中国)，纯水机(优普，中国)，电子天平(Sartorius，德国)，WMT-100S Morris水迷宫(成都泰盟，中国)，酶标仪(Biotek，美国)，恒温培养箱、注射器及眼科剪、眼科镊、玻璃匀浆器等均为国产。白介素-1β(IL-1β)测试盒(南京建成，中国)。

1.3 采集PM2.5微粒并制备混悬液

大气PM2.5 微粒样品由四川科信时代检测技术有限公司于2016年7月14日至7月30日(共17天)在成都市武侯区科园南路9-1爱思特大厦楼顶(半径2公里范围内有地铁3号线和10号线施工工地以及南三环大量汽车流通过)采集，每天采集24 h。将采集到PM2.5的玻璃纤维滤膜放入超纯水中，经超声振荡洗脱、收集洗脱液、过滤、以及真空冷冻干燥，提取得到PM2.5微粒样品。用电子天平秤取9.6 mg、38.4 mg、和153.6 mg的PM2.5微粒，分别溶于25 mL的生理盐水配置成低、中、高剂量PM2.5混悬液，使其浓度分别为0.384 mg·mL-1、1.536 mg·mL-1、6.144 mg·mL-1。将三组PM2.5混悬液置于4℃冰箱保存，使用前超声振荡30min并高温高压灭菌，使混悬液无菌且PM2.5微粒均匀分散其中。

1.4 大鼠分组与PM2.5染毒造模

以Morris水迷宫实验对所有大鼠进行筛选，将筛选后的32只大鼠随机分为4组，每组8只，分别为对照组及PM2.5低、中、高剂量组。各组大鼠经乙醚麻醉后，采用气管滴注法染毒。低、中、高剂量组每只大鼠分别注入剂量为0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、15.36 mg·kg-1的PM2.5混悬液，对照组按同样方法注入生理盐水，每周染毒2次，共3 w。

1.5 Morris水迷宫实验

最后1次染毒1天后开始进行Morris 水迷宫实验以检测各组大鼠的学习记忆能力。每只大鼠连续接受5天定位航行实验(Place navigation)的训练并记录其潜伏期。训练期间，每只大鼠分别从4 个象限的固定入水点进入水迷宫中，并以登上平台为最终目标；若大鼠人水后60 s内未能找到平台，则人工引导其来到平台位置并停留10 s。第6天撤去平台进行空间探索实验(Spatial probe test)，将大鼠从与定位航行实验相同的入水点放入水中，记录其在原平台所在象限内游泳所花的时间，即有效区域运动时间。

1.6 采集样本和肺组织IL-1β检测

水迷宫实验结束后处死大鼠，取肺组织保存于-80℃低温冰箱待测。每个样本秤取0.5 g肺组织在玻璃匀浆器中制成匀浆。按照白介素-1β(IL-1β)测试盒(南京建成)说明书，用ELISA 的方法检测肺组织匀浆中IL-1β的浓度。

1.7 统计学分析

应用SPSS 13.0 统计软件进行处理，结果数据以-X±SD表示。对Morris水迷宫中定位航行实验的潜伏期采用重复测量数据的多因素方差分析，组间比较采用方差分析的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PM2.5染毒对大鼠学习记忆的影响

定位航行实验的结果显示，染毒大鼠的潜伏期均较对照组有所增加(P<0.05)，高剂量组潜伏期的增加明显多于低剂量组和中剂量组(P<0.05)，但低剂量组和中剂量组潜伏期的增加差异无统计学意义，见图1。

图1 大鼠定位航行实验的潜伏期

空间探索实验的结果显示，对照组大鼠的有效区域运动时间明显高于三组染毒大鼠(P<0.05)，染毒大鼠的有效区域运动时间长度与染毒计量呈反比，即高剂量组的有效区域运动时间短于中剂量组，中剂量组的有效区域运动时间短于低剂量组，见表1。

2.2 PM2.5染毒对大鼠肺组织的影响

ELISA结果显示，对照组大鼠肺组织内的IL-1β含量比低剂量组稍高(P>0.05)，差异无统计学意义；而中、高剂量组大鼠肺组织的IL-1β含量比对照组明显升高(P<0.05)，见表2。

表1 空间探索实验中大鼠游泳的有效区域运动时间±S，n=8)

注：与对照组相比，*P<0.05。

表2 大鼠肺组织匀浆中IL-1β的水平

注：与对照组相比，*P<0.05。

3 讨论

成都市区现阶段的大气污染源主要来自汽车尾气和工地施工。本实验中，PM2.5的采集地点设在成都市区内同时接近地铁施工工地和大流量车流道路的地方，可以最大程度的模拟目前成都大气中PM2.5的成分。从Morris水迷宫实验的结果可知，染毒大鼠寻找平台的空间学习记忆能力比对照组差，也就是说，成都空气中的PM2.5确实会对大鼠的学习记忆能力造成影响，而且这种影响与PM2.5的浓度有关，浓度越高，影响越大。从图1我们可以看到，在定位航行实验的第5天，低剂量组和中剂量组的潜伏期较之前有明显降低，其中低剂量组的潜伏期时间更接近于对照组，而高剂量组的潜伏期则仍然较长。这说明较低浓度PM2.5对大鼠学习记忆的损害也许是可以恢复的，但高浓度PM2.5造成的损害则不易恢复。

考虑到PM2.5直接作用于大鼠的气管和肺，而缺氧能够导致学习记忆的损伤[8]，因此本实验通过检测大鼠肺部IL-1β的水平，以判断染毒大鼠肺部是否有炎症。结果表明，低剂量的PM2.5混悬液滴注没有引起大鼠肺部明显的炎症，但低剂量组大鼠的空间学习记忆却也受到了损害，而中剂量和高剂量的PM2.5混悬液滴注的确引起了其肺部一定程度的炎症，因此，我们认为，在PM2.5混悬液滴注引起的大鼠空间学习记忆能力损害中，肺部炎症可能对具有促进作用，但它并不是一个关键的因素。至于其中的机制，则需要进一步研究。

1 汪安璞. 大气气溶胶研究新动向[J]. 环境化学, 1999, 18(01): 10-15.

2 曲红梅,牛静萍,魁发瑞,等. 大气中PM_(2.5)致大鼠呼吸道急性损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2006, 22(05): 598-599.

3 肖纯凌,王任群,赵肃,等. 大气混合污染物对大鼠呼吸系统氧化损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2006, 22(08): 935-936.

4 李志梅,段争. PM2.5急性暴露对大鼠凝血功能的影响及其机制[A]. 中华医学会呼吸病学年会——2013第十四次全国呼吸病学学术会议论文汇编[C]. 中华医学会、中华医学会呼吸病学分会, 2013, 1.

5 Meng Z, Zhang Q. Damage effects of dust storm PM2.5 on DNA in alveolar macrophages and lung cells of rats [J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45(8): 1368-1374.

6 Gatto NM, Henderson VW, Hodis HN, et al. Components of air pollution and cognitive function in middle-aged and older adults in Los Angeles [J]. Neurotoxicology, 2014, 40: 1-7.

7 陈旭锋,李太山,徐文哲,等. PM2.5染尘大鼠海马中铅铝锰含量及神经递质的变化[J]. 环境与健康杂志, 2015, 32(01): 73-75.

8 Arteaga O, Revuelta M, Uriguen L, et al. Docosahexaenoicacid reduces cerebral damage and ameliorates long-term cognitive impairments caused by neonatal hypoxia-ischemia in rats [J]. Mol Neurobiol, 2016, [Epub ahead of print].

Effect of PM2.5 in the polluted air of Chengdu on rats′ learning and memory ability*

Zhang Xiao-long1, Ren Jie1, Wang Zheng-rong1△, Ying Zheng-qi1, Wang Xia2, Huang Yu-yao3, Hou Wang1, Cheng Shu-ting1

(1.College of Basic Medicine and Forensic Medicine, Sichuan University; 2.College of Clinic Medicine, Sichuan University; 3. College ofStomatology, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective：To investigate the effect of PM2.5 in the air of Chengdu on rats′ spatial learning and memory ability by Morris water maze. Methods: Thirty-two male SD rats screened by Morris water maze were randomly divided into control group, PM2.5 lower dosage group, PM2.5 middle dosage group, and PM2.5 higher dosage group (n=8). The rats were exposed to PM2.5, which was collected by EM-2062A Particulates Sampler from July 14thto 30thof 2017 in Chengdu, by intratracheal instillation, and the exposing dosage was depended on rats′ mass, that is 0.96 mg·kg-1in lower dosage group, 3.84 mg·kg-1in middle dosage group, and 15.36 mg·kg-1in higher dosage group. Learning abilities of those rats were estimated with Morris water maze 3 weeks later, and the IL-1β level was tested by ELISA. Results: Compared to the control, the escape latency time of treated rats was longer, and the higher dosage group has the longest escape latency time (P<0.05), while there was a reverse correlation between the effective regional time of rats and PM2.5 dosage. Conclusion: PM2.5 in the polluted air of Chengdu has the ability to impair rats′ ability of learning and memorizing, and this impairment was associated to the concentration of PM2.5.

Chengdu; PM2.5; Rats; Ability of learning and memorizing

四川大学国家级大学生创新训练计划项目(201610610100)

张霄龙，男，2014级本科生，Email：462251694@qq.com

△通讯作者：王正荣，男，教授，主要从事时间生物学研究，Email：wangzhengrong@126.com。

2017-4-21)