Oridonin对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的影响及其机制研究*

邓怡林，于合国，施敏，石翠翠，范建高，李光明

·实验性肝炎·

Oridonin对急性肝衰竭小鼠肝细胞凋亡的影响及其机制研究*

邓怡林，于合国，施敏，石翠翠，范建高，李光明

目的 探讨冬凌草甲素（oridonin）对脂多糖/D-氨基半乳糖氨（LPS/D-Gal）联合诱导的急性肝衰竭（ALF）小鼠肝细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 取25只小鼠，随机分成5组，每组5只。采用LPS/D-Gal腹腔注射建立小鼠ALF模型，设生理盐水对照组、LPS/D-Gal诱导模型组、LPS/D-Gal诱导和不同剂量oridonin干预组及oridonin处理组。采用末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测肝细胞凋亡，采用real-time PCR法检测肝组织TNF-α mRNA水平，采用Western blot法检测凋亡相关蛋白的变化。结果 模型组小鼠肝细胞凋亡率为（36.4±1.8）%，显著高于两个oridonin干预组的［（19.4±3.3）%和（11.4±0.3）%，P＜0.01］；模型组小鼠肝组织TNF-α mRNA水平显著高于正常对照组（P＜0.01），而两个oridonin干预组肝组织TNF-α mRNA水平显著低于模型组（P＜0.01）；模型组小鼠线粒体凋亡通路相关的促凋亡蛋白c-Jun氨基末端激酶（JNK）、bax、细胞色素C、cleaved caspase9/3活化水平显著高于两个oridonin干预组（P＜0.01），模型组小鼠抗凋亡蛋白bcl-xl水平显著低于两个oridonin干预组（P＜0.01），模型组小鼠死亡受体凋亡通路相关的促凋亡蛋白caspase8活化水平与两个oridonin干预组并无明显差异（P＞0.01）。结论 Oridonin可抑制LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠肝细胞凋亡，其机制可能与下调促凋亡细胞因子TNF-α水平和抑制JNK介导的线粒体凋亡信号通路有关。

急性肝衰竭；D-氨基半乳糖氨；冬凌草甲素；凋亡；小鼠

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）病情凶险，进展迅速[1]，目前尚无有效治疗手段[2，3]。肝细胞凋亡是ALF早期一种重要的病理学表现[4]，如能阻抑肝细胞凋亡，则有望延缓甚至阻断ALF的病情进展[5]。冬凌草甲素（oridonin）是从中药冬凌草中分离出来的活性双萜类化合物，具有广泛的抗肿瘤[6，7]、抗炎[8，9]等生物学活性。我们之前的研究已经表明oridonin对ALF小鼠具有保护作用，然而这种保护作用是否与其对肝细胞凋亡的阻抑作用有关尚不清楚。因此，本研究以LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠作为模型，进一步探讨oridonin对ALF小鼠肝细胞凋亡的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂与药物 6～8周龄，雌性SPF级，体质量为20～22 g的C57/BL6小鼠购自中国科学院上海生命科学研究院，在清洁级动物实验中心喂养（标准动物饲料及饮水，环境温度为21±2℃，12 h明暗交替光照时间）。所有动物实验均符合本校动物伦理委员会的有关规定。D-Gal和LPS（E.Coli,菌株O111:B4）购自美国Sigma公司。Oridonin购自美国Selleck公司。RIPA裂解液（强）购自江苏凯基生物技术股份有限公司。蛋白酶抑制剂cocktail及末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色试剂盒购自美国Roche公司。BCA试剂盒购自北京北方同正生物技术发展有限公司。ReverTra Ace qPCR RT Kit购自日本Toyobo公司，SYBR@Green Real-time PCR Master Mix购自上海ExCell Bio公司。抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）、抗磷酸化c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）、抗细胞色素c（cytochrome c）、抗含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶8（caspase8）、caspase9、caspase3、抗 bax、抗 bcl-xl 抗体及抗GAPDH抗体均为美国CST公司产品；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG均购自上海Beyotime公司。

1.2 急性肝衰竭模型的建立及药物干预 取25只小鼠，随机分成5组，每组5只。a组（正常对照组）：NaCl+NaCl，腹腔注射0.5 ml生理盐水，1 h后注射同等体积的生理盐水；b组（模型组）：NaCl+LPS（40 μg/只）/D-Gal（5 mg/只），腹腔注射0.5 ml生理盐水，1 h后注射同等体积LPS/D-Gal的混合溶液；c组和 d组（药物干预组）：oridonin（0.2 mg/只）+LPS（40μg/只）/D-Gal（5 mg/只），其中c组：腹腔注射0.5 m l oridonin（0.2 mg/只），1 h后腹腔注射同等体积的LPS/D-Gal混合溶液；d组：每4天腹腔注射一次0.5 ml oridonin，共 3次，最后一次给药后1 h腹腔注射同等体积的LPS/D-Gal混合溶液；e组

（药物对照组）：oridonin+NaCl，腹腔注射 0.5 ml oridonin（0.2 mg/只，oridonin溶于生理盐水中），1 h后注射同等体积的生理盐水。LPS/D-Gal诱导6 h后，取部分肝组织浸泡于4%多聚甲醛溶液中。另取肝组织经液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存，备检。1.3肝组织细胞凋亡检测 采用TUNEL染色法，取固定于多聚甲醛中的肝组织，经过常规脱水、浸蜡、包埋，制成5μM切片，按照试剂盒说明书进行TUNEL染色。

1.4 肝组织TNF-α mRNA水平检测 采用RT-PCR法，以Trizol法提取肝组织RNA，经紫外分光光度计测定RNA纯度，取吸光度A260/A280为1.8～2.0的RNA用于逆转录，采用Real-time PCR试剂盒行PCR扩增，每个反应体系共20μl，包括DNA 模板（10 ng/μl） 1.4μl，SYBR 10 μl，引物1.6μl（10μM）和ddH2O 7 μl。反应条件为95℃预变性 10 min，95℃变性 20s，58℃退火 30 s，72℃延伸25 s，40个循环。以GAPDH为内参照，运用2-△△CT法分析结果。所有引物均由美国Thermo Fisher Scientific公司合成，其序列分别为：TNF-α：正 义 链 ，5’-CTC CCA GGT ATA TGG GCT CA-3’， 反 义 链 ：5’-CCA GGT TCT CTT CAA GGG AC-3’；GAPDH：正义链，5’-TCC AAG GAG TAA GAA ACC CTG GAC-3’，反义链，5’-GTT ATT ATG GGG GTC TGG GAT GG-3’。

1.5 肝组织凋亡相关蛋白表达检测 采用Western blot法，以含有蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液（强）提取肝组织蛋白，在超声仪上充分裂解后，冰浴30 min。于4℃ 12000 g离心15 min。吸取上清，以BCA法进行蛋白定量，沸水煮沸5 min，使蛋白充分变性，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），检测促凋亡蛋白JNK/P-JNK、cytochrome C、caspase8/9/3、bax和抗凋亡蛋白 bcl-xl表达的变化。应用Image J系统分析电泳条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理 应用GraphPad Prism 6.0进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采取独立样本t检验。P＜0.05和P＜0.01表示差异具有显著和非常显著性统计学意义。

2 结果

2.1 ALF小鼠肝组织细胞凋亡的变化 经TUNEL染色，结果显示模型组小鼠肝细胞凋亡率为（36.4±1.8）%，显著高于正常对照组的［（1.4±0.5）%，P＜0.01］；oridonin干预的 c组和 d 组肝细胞凋亡率分别为（19.4±3.3）%和（11.4±0.3）%，显著低于模型组（P＜0.01，图1）。

图1 肝组织细胞凋亡情况（TUNEL染色，200×）

2.2 ALF小鼠肝组织TNF-α mRNA水平变化 经Real-time PCR检测显示，模型组小鼠肝组织TNF-αmRNA水平显著高于正常对照组（P＜0.01）；oridonin干预的c组和d组肝组织TNF-α mRNA水平明显低于模型组（P＜0.01，图 2），提示 oridonin可明显抑制LPS/D-Gal诱导的促凋亡细胞因子TNF-α mRNA水平的上调。

图2 ALF小鼠肝组织TNF-α mRNA水平的变化

2.3 ALF小鼠肝组织促凋亡蛋白JNK的变化 模型组小鼠肝组织P-JNK表达显著高于正常对照组（P＜0.01）；oridonin干预的 c组和 d组 P-JNK 表达水平显著低于模型组（P＜0.01，图 3），提示 oridonin可明显抑制LPS/D-Gal诱导的促凋亡信号JNK的激活。

图3 肝组织促凋亡信号JNK的变化

2.4 ALF小鼠凋亡相关蛋白的变化 caspase8是死亡受体凋亡途径的关键蛋白，细胞色素C、caspase 9和bax是线粒体凋亡途径的关键蛋白[12]，bcl-xl是bcl-2家族中的抗凋亡蛋白[13]，caspase3是一种凋亡效应蛋白，cleaved caspase8/9/3/为caspase8/9/3的活化形式。经Western blot检测显示，模型组促凋亡蛋白caspase8、细胞色素 C、bax、caspase9 和 caspase3 活化水平明显增加，显著高于正常对照组（P＜0.05，图4）。Oridonin预处理的c组和d组线粒体凋亡相关的促凋亡蛋白细胞色素C、bax、caspase9和caspase3活化水平明显下降，显著低于模型组（P＜0.05，图4）；同时，抗凋亡蛋白bcl-xl表达上调，显著高于模型组（P＜0.05，图 4）。然而，oridonin预处理的 c组和 d组凋亡启动蛋白caspase8活化水平与模型组无明显差异。oridonin可抑制LPS/D-Gal的 ALF小鼠肝细胞凋亡，至少部分与抑制线粒体凋亡途径有关。

图4 ALF小鼠凋亡相关蛋白的变化

3 讨论

我们前期研究结果表明，oridonin对LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠具有明显的保护作用，表现为ALF小鼠生存率的显著提高，肝组织病理学损伤的减轻及血清肝脏酶学指标的下调。肝细胞凋亡是一种短时相病理改变，是ALF早期的一种重要病理学表现，也是药物治疗的重要靶点[5，10]。我们的研究结果证实在LPS/D-Gal诱导小鼠ALF早期，存在广泛的肝细胞凋亡，oridonin干预可显著减轻LPS/D-Gal诱导的肝细胞凋亡，提示oridonin对ALF的保护作用可能部分与抑制肝细胞凋亡相关。

诱导肝细胞凋亡的刺激因素很多，包括炎症因子（如TNF-α）、线粒体损伤、缺氧等，在ALF发病进程中，它们常相互叠加，促进疾病进展[14，15]。死亡受体途径（由TNF-α及FasL启动）和线粒体凋亡途径（由Bcl-2家族蛋白调控）是介导细胞凋亡的两条经典途径[16]。TNF-α是LPS/D-Gal诱导ALF中主要的促凋亡因子[10]。TNF-α与TNFR1结合后招募一系列胞内蛋白而后激活凋亡起始蛋白caspase8，进而启动凋亡级联反应[17]。我们研究发现oridonin可明显抑制模型组小鼠肝组织TNF-α表达，而凋亡起始蛋白caspase8却无明显变化，提示oridonin对ALF的保护作用可能与抑制TNF-α介导的细胞凋亡有关，但似乎并不是通过抑制TNF-α介导的死亡受体通路来发挥作用的。

JNK是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员[12]，可由细胞应激、炎症因子（TNF-α）等因素诱导激活，其中研究最为广泛的是，TNF-α通过与TNFR1结合，介导JNK的激活[18]。TNF-α介导的细胞凋亡与持续激活的JNK信号通路有关[19]。基于JNK2基因敲除小鼠及JNK激酶抑制剂SP600125的研究表明，JNK可通过诱导线粒体膜通透性改变、细胞色素C释放和bid转位，介导肝细胞凋亡[4，11，20]。因此，在 ALF 动物，TNF-α 不仅可直接诱导肝细胞凋亡，还可通过激活JNK介导的线粒体凋亡通路，从而显著放大TNF-α的促凋亡效应。为了进一步阐明oridonin的抗凋亡机制，我们检测了JNK及线粒体通路相关促凋亡和抗凋亡蛋白表达。研究发现，在LPS/D-Gal诱导的ALF小鼠，TNF-α上调可能是肝细胞凋亡的启动因素，而JNK激活介导的线粒体途径才是ALF早期肝细胞大量凋亡的关键。oridonin干预可显著逆转JNK激活，下调线粒体相关促凋亡蛋白表达，并上调抗凋亡蛋白bcl-xl表达，同时伴随肝细胞凋亡的显著减轻，表明oridonin的抗凋亡效应主要与JNK介导线粒体凋亡通路有关。

综上所述，我们研究证实oridonin对ALF小鼠的保护作用至少部分与抑制TNF-α表达及JNK介导线粒体凋亡通路有关，提示oridonin在干预ALF方面具有潜在的应用前景。

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（收稿：2016-11-17）

（本文编辑：陈从新）

Suppression of TNF-αand JNK-related pro-apoptotic signaling expression of oridonin in m ice w ith LPS/D-Gal-induced acute liver failure

Deng Yilin，Yu Heguo，Shi Min，et al.Department of Gastroenterology， Xinhua Hospital Affiliated to Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Objective To investigate the anti-apoptosis effect of oridonin in mice with lipopolysaccharide（LPS）/D-galactosamine（D-Gal）-induced acute liver failure（ALF）.Methods 25 mice were randomly divided into five groups （5 in each），e.g.，normal，model，oridonin-intervened and oridonin-intervened at different doses，and oridonin for 12 days.ALF model was established in C57BL/6 mice by intraperitoneal injection of LPS/D-Gal.TUNEL，real-time PCR and Western blot were applied to related detection.Results Hepatocyte apoptosis rate in mice in model group was（36.4±1.8）%，significantly higher than that in oridonin-intervened groups[（19.4±3.3）%and （11.4±0.3）%，respectively，P<0.01]；administration of oridonin significantly decreased hepatic TNF-α mRNA level in model group （P<0.01）；the expressions of mitochondrial-dependent pro-apoptotic protein such as JNK，bax，cytochrome C，cleaved caspase8/9/3 were upregulated in the model group as compared to in the control group;Pretreatment with oridonin significantly reversed the changes of apoptosis signal pathway induced by LPS/D-Gal，the expression of caspase 8 was not significantly changed and the expression of anti-apoptotic protein bcl-xl increased.Conclusion Oridonin has an anti-apoptosis effect on LPS/D-Gal-induced ALF in mice，and its mechanism may be related to the suppression of pro-apoptotic cytokine TNF-αand JNK-related pro-apoptotic signaling.

Acute liver failure；D-galactosamine；Oridonin；Apoptosis；Mice

国家自然科学基金资助项目（编号：81400631/81570549）

200092上海市 上海交通大学医学院附属新华医院消化内科（邓怡林，石翠翠，范建高，李光明）；附属同仁医院消化内科（施敏）；上海市计划生育科学研究所（于合国，刁华）

邓怡林，女，25，硕士研究生。主要从事肝损伤及肝纤维化的防治研究

李光明，E-mail:ligm68@126.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.005