理气活血滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织形态学和抗氧化性的影响

李尧锋 彭 芳 陈向云 朱 璨 杨长福 田紫平 熊仕芳 张永萍*

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州益佰制药股份有限公司，贵州 贵阳 550008

实验研究

理气活血滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织形态学和抗氧化性的影响

李尧锋1彭 芳1陈向云1朱 璨1杨长福1田紫平2熊仕芳2张永萍1*

1.贵阳中医学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州益佰制药股份有限公司，贵州 贵阳 550008

目的：研究理气活血滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织的保护作用。方法：SD大鼠随机分为假手术组，心肌缺血再灌注损伤模型组，阳性对照组和理气活血滴丸低、中、高剂量组，阳性对照组大鼠给予辛伐他汀，假手术组和模型组大鼠灌胃等量的生理盐水。灌胃给药10d后，采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法复制心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。记录大鼠心电图ST段变化，TTC染色法检测心肌梗死范围，生化检测心肌组织SOD、CAT活性及MDA含量。结果：理气活血滴丸能降低心肌缺血再灌注损伤大鼠心电图ST段的抬高，缩小心肌梗死范围，升高心肌组织SOD、CAT活性，降低MDA含量，且呈剂量依赖性。结论：理气活血滴丸对心肌缺血再灌注损伤大鼠的心肌组织具有保护作用。

理气活血滴丸；大鼠；心肌缺血再灌注损伤；抗氧化

心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia-reperfusion Injury，MIRI)是长时间缺血心肌组织在血液复灌后，出现比缺血前更为严重的功能性损伤，是心肌缺血患者冠脉畅通后常见的严重并发症[1]。目前，药物性预适应是防护缺血再灌注心肌损伤的便捷手段。中药在保护心肌缺血再灌注损伤方面，具有毒副作用小、多靶点、多环节作用的优点，近来被国内外医学研究者广泛关注[2-4]。理气活血滴丸是根据贵州苗族民间验方和传统中医药理论制成的中药复方制剂，由苗药米槁精油、川芎、薤白、艾片组成，具有温阳宽胸，理气活血的功效，在治疗冠心病、心绞痛疗效较好[5]。前期研究表明理气活血滴丸对MIRI大鼠具有保护作用，该作用与其减少心肌细胞心肌酶漏出和抑制炎性损伤有关[6]，但其是否具有抗氧化作用尚不清楚。本研究采用结扎冠状动脉前降支的方法复制心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，再通过组织形态学方法和生化检测抗氧化相关指标，进一步明确理气活血滴丸对MIRI大鼠心肌组织的保护作用。

1 仪器与材料

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠120只，雄性，体重(180±20)g，购自长沙天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2014-0010。

1.2 药物与试剂 理气活血滴丸(批号：20140802，贵州益佰制药股份有限公司)；辛伐他汀片(批号：141107，杭州默沙东制药有限公司)；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号：20151208)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(批号：20151214)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号：20151215)、总蛋白测定试剂盒(批号：20151102)购于南京建成生物工程研究所；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，批号：20150812)和苏木精-伊红(HE，批号：20151106)染色试剂盒购于北京索莱宝试剂有限公司。

1.3 仪器 BL-420F生物机能实验系统和HX-101E动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司)；石蜡切片机(德国莱卡公司)。

2 方法

2.1 分组与给药 将SD大鼠随机分为6组，每组20只，分别为假手术(冠状动脉前降支下穿线不结扎)组，心肌缺血再灌注损伤模型组，阳性对照组，理气活血滴丸低(43.75mg/kg/d)、中(87.50mg/kg/d)、高(175.00mg/kg/d)剂量组。各组动物连续灌胃给药7d，阳性对照组给予辛伐他汀(40mg/kg/d)，假手术组和模型组灌胃等量的生理盐水。

2.2 造模 各组大鼠术前禁食禁水12h，末次给药45min后，腹腔注射25%乌拉坦麻醉。将大鼠仰卧固定于手术台上，做气管插管，连接小动物呼吸机(频率80～90次/min，潮气量2mL/100g，呼、吸比3∶2)。连接BL-420F生物机能实验系统，记录大鼠肢体Ⅱ导联心电图。然后开胸，剪开心包，暴露心脏，造模组用5号丝线结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)，以左室前壁呈紫绀或蓝紫色及同步心电图显示QRS幅度升高，ST段抬高为结扎成功标志。缺血0.5h后松开丝线，复灌1h，建立MIRI大鼠模型[7]。

2.3 心肌组织生化指标测定 复灌后留取心脏，用冰生理盐水清洗干净，称重，加入预冷的生理盐水，匀浆，制成10%的心肌组织匀浆液。然后采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，可见光法测定CAT活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，试验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.4 心肌梗死范围测定 切取左心室，用生理盐水清洗干净，滤纸吸干称重。然后将其置于装有1%TTC溶液的器皿中，37℃避光15min，染色过程中不时摇动染色液。染色后立即用蒸馏水冲洗掉多余的染液，非梗死区呈玫瑰红色，梗死区呈白色或灰白色。小心分离梗死区与非梗死区，称量梗死区质量，然后计算梗死范围占左心室的百分比。

3 结果

3.1 理气活血滴丸对MIRI模型大鼠心电图ST段的影响 由表1可知，与假手术组比较，模型组大鼠在缺血0.5h和再灌注1h，其心电图Ⅱ导联ST段均明显抬高，表明建模成功。与模型组比较，理气活血滴丸低剂量组大鼠心电图ST段无明显变化。与模型组比较，理气活血滴丸中、高剂量组和阳性对照组大鼠ST段降低，且存在统计学差异(P<0.05或P<0.01)。

组别正常心电图缺血0.5h心电图再灌注1h心电图假手术组0.101±0.0120.125±0.0160.123±0.013模型组0.099±0.0170.324±0.026**0.245±0.019**阳性对照组0.094±0.0150.257±0.014##0.141±0.012##理气活血滴丸低剂量组0.098±0.0230.343±0.0170.240±0.030理气活血滴丸中剂量组0.106±0.0130.297±0.040#0.167±0.021##理气活血滴丸高剂量组0.100±0.0200.220±0.031##0.159±0.015##

注：与假手术组比较，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05。

3.2 理气活血滴丸对MIRI模型大鼠心肌梗死程度的影响 由表2可知，假手术组大鼠心肌组织染色后未见梗死区，模型组大鼠心肌梗死区占左心室重的百分比为35.68%。与模型组比较，理气活血滴丸低剂量组大鼠心肌梗死程度未见明显改善，其心肌梗死区占左心室重的百分比为32.21%，而理气活血滴丸中、高剂量组和阳性对照组大鼠心肌梗死程度显著改善，其心肌梗死区占左心室重的百分比分别为24.54%、22.31%和19.24%。

组别左心室/g梗死区/g梗死区/左心室/%假手术组0.707±0.05200模型组0.721±0.0530.257±0.05135.68±5.12阳性对照组0.695±0.0620.134±0.042##19.24±4.98##理气活血滴丸低剂量组0.710±0.0700.229±0.03832.21±6.01理气活血滴丸中剂量组0.697±0.0640.171±0.047##24.54±4.23##理气活血滴丸高剂量组0.730±0.0720.163±0.060##22.31±4.61##

注：与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05。

3.3 理气活血滴丸对MIRI模型大鼠心肌组织SOD、CAT活性及MDA含量的影响 由表3可知，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织SOD和CAT活性明显降低，MDA含量明显升高。与模型组比较，理气活血滴丸低剂量组大鼠心肌组织SOD、CAT活性及MDA含量无统计学差异(P>0.05)。与模型组比较，理气活血滴丸中、高剂量组和阳性对照组大鼠心肌组织SOD、CAT活性明显升高，MDA含量明显下降(P<0.05或P<0.01)。

组别SOD/U/mgprotCAT/U/mgprotMDA/nmol/mgprot假手术组288.32±12.4627.57±1.322.43±0.32模型组160.54±14.27**18.21±1.45**8.91±0.58**阳性对照组263.23±12.59##24.25±1.34##3.22±0.36##理气活血滴丸低剂量组190.98±10.2819.58±2.017.83±0.76理气活血滴丸中剂量组247.48±13.53##21.89±1.94#4.75±0.59##理气活血滴丸高剂量组258.12±13.18##22.32±1.53##3.43±0.40##

注：与假手术组比较，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05。

4 讨论

本研究选用单一性别雄性大鼠建立MIRI动物模型，一方面雄性大鼠对利用结扎左冠状动脉前降支方法制作的MIRI动物模型耐受性较强，另一方面可排除性别差异导致的试验结果标准差偏大，此外选用单一性别利于控制试验，排除交配、发育等因素的干扰。

心肌缺血再灌注损伤的发生机制比较复杂，在再灌注期最初数分钟内可形成一过性活性氧(ROS)升高，引起心肌细胞氧化损伤，是心肌细胞凋亡或死亡的主要原因[8-9]。哺乳动物细胞内有抗氧化防御的酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等，若这些酶清除不了过多的ROS，这样就对心肌细胞产生了损伤作用。线粒体呼吸链是ROS的主要来源，心肌缺血后再灌注期线粒体产生大量ROS，导致线粒体膜可通透性转运孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)开放[10-11]。mPTP的开放导致线粒体水肿胀破，释放细胞色素C等凋亡蛋白。细胞色素C是线粒体呼吸链中传递电子的重要载体，细胞色素C的缺失，一方面影响细胞能量代谢，另一方面激活Caspase家族，进而诱发心肌细胞凋亡[12]。因此，防止细胞内ROS过度增长或增强线粒体mPTP的稳定性，是保护心肌缺血再灌注损伤的一种重要策略。SOD和CAT是机体内清除氧自由基的重要抗氧化相关酶类，其活性的高低直接反应机体的抗氧化能力[13]。另外，细胞膜脂质过氧化的产物MDA是衡量体内抗氧化情况的重要检测指标之一[14]。实验结果显示理气活血滴丸能显著升高再灌注期大鼠心肌细胞SOD和CAT活性，降低MDA含量，说明理气活血滴丸可清除再灌注期过多的活性氧，减轻细胞膜脂质过氧化反应，防护再灌注期心肌细胞的氧化应激损伤。

研究也发现理气活血滴丸预处理能有效降低MIRI大鼠心电图ST段的抬高。在组织形态学方面，理气活血滴丸能显著减小MIRI大鼠心肌梗死范围，改善再灌注期心肌细胞的损伤，且呈剂量依赖性。因此，理气活血滴丸对MIRI大鼠心肌组织的保护作用与其抗氧化性有关，另外我们以往研究结果发现理气活血滴丸对MIRI大鼠的保护作用也与其抑制炎性损伤有关[6]，推测理气活血滴丸对MIRI大鼠心肌组织具有多靶点保护作用。

综上，理气活血滴丸对MIRI大鼠心肌组织具有明显的保护作用，并提示该保护机制与其抑制炎性损伤和抗氧化性有关，但其具体作用的分子机制有待进一步研究。

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Influence of Liqihuoxue Dropping pills of Myocardial Morphology and Antioxidation in Rats with Myocardial Ischemia-reperfusion Injury

LI Yaofeng1PENG Fang1CHEN Xiangyun1ZHU Can1YANG Changfu1TIAN Ziping2XIONG Shifang2ZHANG Yongping1*

1.Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Yibai Pharmaceutical Co.Ltd.,Guiyang 550008,China

Objective To observe the protective effect of Liqihuoxue Dropping pills on myocardial ischemia-reperfusion injury(MIRI) in rats. Methods SD rats randomized into the sham group, the MIRI model group, the positive control group and the Liqihuoxue Dropping pills low, medium and high dose groups. Rats in the positive control group were given Simvastatin, rats in sham operation group and model group were given the same amount of saline. Rats were administrated for ten days, and the rats were molded MIRI by closing the left anterior descending coronary artery after the last administration. ST segment changes of rats were recorded. The myocardial infarction range was detected by TTC staining. SOD, CAT activity and MDA content in cardiac tissue were determined by biochemistry method. Results Results showed that the Liqihuoxue Dropping pills could decrease the elevation of ST segment of electrocardiogram in rats with myocardial ischemia reperfusion injury, reduced myocardial infarct size, elevated SOD and CAT activity and decreased MDA content in cardiac tissue, which showed dose-dependent manner. Conclusion It has a protective effect of Liqi Huoxue Dripping pills on myocardial tissue in rats with myocardial ischemia reperfusion injury.

Liqihuoxue Dropping pills; Rat; Myocardial Ischemia-reperfusion Injury; Antioxidation

贵州省科技计划项目(黔科合基础[2016]1401)；贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2016]186)；贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题(QZYY-2016-015)。

李尧锋(1987-)，男，讲师，博士，研究方向为中药心血管药理研究。E-mail：lyfengcxy2010@163.com

张永萍(1964-)，女，教授，硕士生导师，研究方向为中药、民族药新制剂与新剂型开发。E-mail：zgygpg@sohu.com

R285

A

1007-8517(2017)15-0054-04

2017-05-24 编辑：梁志庆)