阿尔茨海默病患者淋巴细胞中双链RNA-依赖的蛋白激酶水平与认知障碍的相关性

生晓娜, 李潇潇， 张晓炜， 王 珊， 季 光， 郑为娜， 张国华

阿尔茨海默病患者淋巴细胞中双链RNA-依赖的蛋白激酶水平与认知障碍的相关性

生晓娜1, 李潇潇3， 张晓炜2， 王 珊1， 季 光1， 郑为娜1， 张国华1

目的 研究双链RNA-依赖的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)患者外周血淋巴细胞(Peripheral lymphocytes，PBLs)中的表达及活性；探讨其水平及活性改变与AD患者认知障碍的相关性。方法 选取AD、PD及健康老年人各20例，应用蛋白质免疫印迹技术检测PBLs中总PKR及磷酸化PKR(p-PKR)的表达，分析比较3组中PKR表达及活性的差异,并利用皮尔森相关分析探讨PKR表达及活性与AD、PD病程和病情的关系。结果 与正常对照组相比，总PKR、p-PKR蛋白表达水平在AD患者的PBLs中均明显升高(P<0.05)，且总PKR的表达量与AD患者认知障碍严重程度呈正相关(r=0.799，P<0.01)；在PD组PBLs中总的PKR与p-PKR蛋白水平均升高(P<0.05)。结论 在AD患者中，PKR的异常表达及活化不仅体现在中枢神经系统，而且可在PBLs中检测到，其表达量与认知障碍严重程度成正相关，有可能成为AD早期诊断及病情评价的外周标记物。

PKR； 阿尔茨海默病； 外周血淋巴细胞； 认知障碍

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，是老年期痴呆的最常见类型，主要表现为进行性全面认知功能损害。随着人口老龄化进程，阿尔茨海默病发病率逐年上升,严重影响患者的生活质量，也给家庭和社会带来了沉重的生活和经济负担。

目前国内外在AD领域的研究多为动物实验或尸检后研究神经元的受损情况。然而，早期诊断AD是制定治疗策略、控制疾病进程的基础及关键。近期研究表明，在AD中细胞凋亡、细胞周期调控的失衡不仅局限于神经元，而且体现在外周血淋巴细胞。外周血采集方便，易于检测，深入研究可能对临床AD的早期诊断及治疗具有重要意义，但至今尚无这样的标志物为临床所应用。

双链RNA-依赖的蛋白激酶(the double stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)在信号转导、应激、细胞生长、分化和凋亡调控中起重要作用,是阿尔茨海默病调节的关键靶点，已有研究证实在神经变性疾病患者的中枢神经系统中可检测到PKR的异常表达及活化。因此，研究其是否可作为与认知功能减退相关的外周血生物学标记物具有可行性和必然性。

据此，本研究拟通过测定AD患者外周血淋巴细胞中PKR的蛋白表达和活化水平，以帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者和同期健康体检者为对照组进行统计分析，探讨外周血淋巴细胞中PKR水平与AD、PD的关系及病情进程的相关性，为进一步研究方便有效的AD外周标记物和潜在的治疗靶点提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 对象 (1)AD组：系2010年-2011年我院神经内科门诊就诊的20例轻至中度AD患者，其中男7例，女13例；年龄55～72岁，平均年龄(66.75±7.79)岁；病程0.5～4 y，平均病程(2.07±1.72)年；简易精神状态检查(minimental state examination，MMSE)评分在14～18分，平均(15.75±4.16)分；临床痴呆量表评分(Clinical dementia rating，CDR)≦2。入组AD患者均符合美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病协会(the national institute of neurological and communicative disorders and stroke and the Alzheimer’s disease and related disorders association,NINCDS-ADRDA)的很可能AD的诊断标准，且无家族史。(2)PD组：系2010年-2011年就诊本院神经内科门诊的PD患者20例，其中男8例，女12例；年龄52～71岁，平均年龄(64.22±9.23)岁；病程1～4 y，平均病程(2.57±1.05)y；均符合2006年中华医学会公布的PD诊断标准，且已排除认知功能障碍。(3)健康对照组：系本院同期健康体检者20例，其中男8例，女12例；年龄55～73岁，平均年龄(65.45±7.73)岁，年龄和性别构成比与病例组相比无明显差异,经神经心理学检查认知功能正常。

所有入选对象均排除患有严重心、肝、肾及其它全身性系统性疾病、脑卒中病史、精神系统疾病、手术史、外伤史和其它重大疾病史。家族中均无痴呆患者。所有入选患者及健康体检者均由其本人或监护者签署知情同意书，并提供血样，过程符合人权及人道主义和医学伦理。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 所有受检者均于上午9：00～11：00抽取10 ml静脉新鲜抗凝血，用人淋巴细胞分离液分离、收集淋巴细胞， PBS缓冲液洗涤获得淋巴细胞。

1.2.2 提取总蛋白 蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂混合液加入裂解-结合缓冲液重悬淋巴细胞，加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥后即可得到总蛋白。以上过程除干燥外均在4 ℃条件下完成。加入2%十二烷基硫酸钠(SDS)缓冲液，95 ℃水浴溶解沉淀，离心去除不溶物。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blotting)检测PKR、p-PKR水平 用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白(100 μg)进行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，然后恒流下将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%脱脂奶粉室温封闭后，加入相应的一抗(PKR抗体、p-PKR抗体、GAPDH)4 ℃过夜；过夜后加入相应的二抗，室温孵育。采用Odyssey System对图像进行定量分析。

2 结 果

2.1 AD组与正常对照组total-PKR、p-PKR蛋白水平的比较 与正常对照组相比，total-PKR及p-PKR在AD患者的外周血淋巴细胞中蛋白表达水平均明显升高(P<0.05)(见图1、表1)。

2.2 PD组与正常对照组total-PKR、p-PKR蛋白水平的比较 与正常对照组相比，在PD患者的淋巴细胞中，total-PKR蛋白表达水平显著升高，有统计学意义(P<0.05)；p-PKR蛋白表达水平亦升高(P<0.05)(见图1、表1)。

2.3 PKR与AD病程及病情的关系 经Pearson相关分析得出，total-PKR蛋白表达水平及活化与AD患者MMSE评分呈正相关：(1)total-PKR/GAPDH与MMSE评分：r=0.799，P<0.01;(2)p-PKR/total-PKR与MMSE评分：r=0.674，P<0.05。与病程未见相关P>0.1(见图2)。

表1 外周血淋巴细胞中total-PKR、p-PKR蛋白水平在3组间的比较

与正常对照组相比差异有统计学意义*P<0.05

图1 total-PKR、p-PKR在正常对照组、AD组及PD组外周血淋巴细胞的Western-blot检测结果

图2 A：total-PKR蛋白表达水平与AD患者MMSE评分的相关性分析r=0.799，P<0.01；B：p-PKR蛋白表达水平与AD患者MMSE评分的相关性分析r=0.674，P<0.05

3 讨 论

凋亡，作为细胞信号转导的明确机制之一，在神经系统变性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。细胞凋亡是AD神经元死亡的最主要形式，其与细胞周期有着紧密的联系，因而细胞周期重启的失调逐渐为人们研究AD中神经元死亡提供了新视角。双链RNA-依赖的蛋白激酶-PKR，分子量68 kD，为保守双链RNA结合分子家族成员。细胞中的PKR主要分布在细胞质，小部分散在分布于核浆。研究表明[1]，低浓度的dsRNA具有活化PKR的作用，而高浓度的dsRNA却抑制该活化作用。激活的PKR通过促使转录因子NF-κB活化，促进凋亡相关基因的转录和表达，启动细胞凋亡程序。其次，PKR和P38/MAPK通路之间有确定的联系，PKR可以通过IKK和P38途径影响NF-κB通路上基因的转录，诱导凋亡，但是这一过程内在复杂的路径仍需进一步研究[2,3]。再次，IL1、TNF、dsRNA、LPS、IFNs等应激相关信号分子都通过PKR来激活NF-κB通路，启动凋亡程序。如果没有PKR的活化，NF-κB通路虽然能继续作用，但是其作用强度会减弱[2,4]。细胞周期蛋白的起始翻译和调控参与记忆的形成，它包括两条通路：mTOR和PKR。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K/Akt信号通路下游的激酶，与GSK3β并驾齐驱，PKR为联系二者的中间调节激酶。同时，P53也可以在分子水平联系PKR信号通路和mTOR信号通路[1]。

这些研究结果都表明，PKR参与多条信号转导通路，其中很多传导通路和信号因子经研究已证实与神经变性疾病密切相关。所以，研究PKR在以阿尔茨海默病为主的神经变性病中的表达具有现实意义和可行性。最新的研究表明，在AD中，凋亡和细胞周期失调不仅局限于中枢神经元，而且存在于外周细胞[5]；与此同时亦有研究显示PKR蛋白表达水平与PD和HD(亨廷顿病)患者海马区的神经元缺失有关[6,7]。

据此，本研究检测了正常对照者、AD和PD患者外周血淋巴细胞中total-PKR与p-PKR的蛋白水平。结果显示，相较于正常对照组，AD患者淋巴细胞中total-PKR及其活化形式p-PKR水平均显著升高，结果与Julien Couturier等[8,9]在动物实验及尸检中观察到AD大脑海马PKR活性增高相一致，这表明PKR蛋白水平的改变不仅发生在中枢神经元，而且存在于外周血淋巴细胞，可能为AD患者所特有的系统性表现之一，极有可能成为用于AD诊断的外周标记物。但是，近来人们对PKR在脑组织中的表达水平的研究存在争议，国外有动物实验和尸检表明[10]p-PKR在AD转基因小鼠和患者大脑中表达明显增加，而总的PKR表达不增加或减少。对于这样的结果，我们认为与人种、遗传学、方法学上的差异有关，并且PKR在外周血淋巴细胞中的表达与在脑组织细胞中的表达，存在一定的差别。总的来说，有一点大家的看法是一致的：PKR水平与神经退行性疾病特别是阿尔茨海默病相关。

本次实验结果提示，AD患者外周血淋巴细胞与神经元在凋亡和细胞周期调控机制上可能存在相同的缺陷，这为研究其机制和潜在的治疗靶点提供了一种可行、方便的外周细胞模型。

此外，我们的结果表明AD患者淋巴细胞中PKR的蛋白水平及活化与认知障碍严重程度呈正相关。MMSE评分越低，外周血淋巴细胞中PKR的表达水平及活化也就越高。

在本实验中，我们发现PD患者外周血淋巴细胞中PKR蛋白表达水平较正常对照组升高，但是由于目前关于PKR和PD的研究很少，因此本结果提示作为神经变性疾病，在PD中，凋亡及其调控通路的改变可能不仅局限于中枢神经元，同样存在于外周血。

凋亡是神经变性疾病最主要的病理机制之一，PKR在AD动物模型和尸检中虽然有一定的研究，然而鲜见其在人外周血淋巴细胞中的研究，在PD外周血淋巴细胞中的研究国内外未见报道。此外，不加干预、直接检测其中的激酶含量在国内未见报道。本次实验结果表明AD患者淋巴细胞中PKR的表达水平及磷酸化水平均显著升高，并且PKR在淋巴细胞的表达水平及其活化与AD患者的疾病严重程度密切相关。这些发现提示PKR或可做为一条信号通路中的一点或多条信号通路的联络点与其他蛋白或蛋白激酶一起联合用于AD患者早期外周血标志物的检测，从而成为研究AD、PD的另一可行手段，用于病情的早期诊断及评价，并且由于它的广泛表达及便于检验而应用于疾病的人群筛查。

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[2]Alysonl Peel.PKR activation in neurodegenerative disease[J].Joural of Neuropathology and Experimental Neurology,2004,63(2):97-105.

[3]Bortolotto V,Cuccurazzu B,Canonico PL,et al.NF-κB mediated regulation of adult hippocampal neurogenesis:relevance to mood disorders and antidepressant activity[J].Biomed Res Int,2014,612798.

[4]Lynette Steele,Fiona Errington,Robin Prestwich.Proinflammatory cytokine/chemokine production by reovirus treated melanoma cells is PKR/NF-κB mediated and supports innate and adaptive anti-tumour immune priming[J].Molecular Cancer,2011,10:20.

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[10]Julien Couturier,Milena Morel,Raymond Pontcharraud.Interaction of double-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR) with the death receptor signaling pathway in amyloid β(Aβ)-treated cells and in APPSLPS1 knock-in mice[J].The Journal of Biological Chemistry,2010,285(2):1272-1282．

The relationship between cognitive impairment and the double stranded RNA-dependent protein kinase level in peripheral lymphocytes of Alzheimer’s disease

SHENG Xiaona,LI Xiaoxiao,ZHANG Xiaowei,et al.

(Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University，Key Laboratory of Hebei Neurology,Shijiazhuang 050000,China)

Objective To investigate PKR and its activated status levels of expression in peripheral lymphocytes (PBLs) of Alzheimer’s disease(AD),and to discuss the relationship of this change and cognitive disfunction.Methods Healthy control,AD and PD were set up,containing 20 cases respectively.PKR and phospholated PKR (p-PKR) levels of expression in lymphocytes were detected by Western blotting and the changes of total and activated PKR levels were analyzed in three groups.The relationships of PKR and p-PKR expression levels and diseases durations and severities of AD and PD were discussed by Pearson’s correlation analysis.Results Both total PKR and activated status levels were augmented in PBLs of AD patients compared with controls (P<0.05) and total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity (r=0.799，P<0.01).Both PKR and p-PKR levels were increased in lymphocytes of PD patients compared with controls (P<0.05).Conclusion The abnormal expressions of PKR and p-PKR were not only in central neurological system but also in PBLs.Total PKR and p-PKR levels were positively correlated with the cognitive severity of AD patients.Thus PKR may be a potential peripheral biomarker in early diagnosis and cognitive function estimations during AD processes.

PKR; Alzheimer’s disease; Peripheral lymphocytes； Cognitive impairment

2017-04-23；

2017-05-30

河北省重点研发自筹项目(科技惠民工程)(No.162777151)；河北省自然科学基金资助项目(No.H2017206156)

(1.河北医科大学第二医院神经内科；河北省神经病学重点实验室,河北 石家庄 050000; 2.河北医科大学第二医院神经外科,河北 石家庄 050000；3.北京四季青医院神经内科,北京 100097)

张国华,E-mall:zhangguohua1983@sina.com

1003-2754(2017)08-0692-04

R749.1

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