阿尔茨海默病患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的研究

刘 丽， 张 可， 王金春， 曹云鹏

阿尔茨海默病患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的研究

刘 丽1， 张 可2， 王金春1， 曹云鹏3

目的 研究阿尔茨海默病(AD)患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的变化，寻求一种可能作为辅助诊断AD的早期生物学指标。方法 选择42例AD患者和45例认知功能正常的健康对照者分别进行神经功能评定，采用以Optiprep为介质的密度梯度离心方法分离血小板脂质筏，应用点印迹的方法进行鉴定后，采用BCA法测定血小板脂质筏内蛋白含量，比色法及点印迹定量分析法测定其内神经节苷脂GM1含量。结果 在离心管25%～30% Optiprep溶液界面处可见一条白色的闪亮环带，经点印迹法证实，位于第6层的此白色闪亮环带即为脂质筏。AD组血小板脂质筏内蛋白含量略高于对照组，但差异无统计学意义(P=0.1494)。AD组血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，但其与年龄、MMSE评分无相关性。结论 AD组患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量与对照组相比明显升高，故血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量的改变在AD的诊断中有一定的潜在价值，有望成为一种辅助诊断AD的早期生物学指标。

阿尔茨海默病； 脂质筏； β-淀粉样蛋白； 神经节苷脂GM1

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种神经退行性疾病，表现为记忆、认知、语言等功能障碍，日常生活能力进行性减退，并可伴有各种神经精神症状和行为障碍，是导致老年痴呆的主要原因。虽然确切发病原因还不清楚，但大量资料表明，β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉积在AD的发病中起到重要的作用。

目前AD的诊断主要依据临床判断、神经心理学测验评估及神经影像学改变。临床诊断的AD患者基本都处于中晚期，治疗效果不佳，因此AD的早期诊断及治疗十分关键，寻找能帮助AD临床诊断的生物学指标有着很大的意义。

近年研究表明脂质筏在AD的病理发生及发展过程中发挥重要作用，参与Aβ致AD发病的全过程[1]。而血小板因在Aβ生成方面具有类似于神经元的生物学特性，可能反映了AD疾病中神经元的发病机制，常被作为AD研究的有用的外周模式系统。因此在本研究中，我们对阿尔茨海默病(AD)患者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1进行研究，检测了临床诊断为AD的42例患者外周血血小板脂质筏内神经节苷脂GM1水平，同时与45例智能正常老年人外周血血小板脂质筏内神经节苷脂GM1检测结果进行对照分析。探讨血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量与AD的关系，以期寻找到对AD诊断具有辅助作用的生物学标志物。

1 资料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 AD组 2014年6月-2016年12月于神经内科诊治的AD患者，所有患者均进行MMSE、蒙特利尔认知评估量表、日常生活能力量表、临床痴呆评定量表、Hachinski缺血量表和汉密顿抑郁量表评分评定，均符合美国国立神经病及语言障碍和卒中研究所-AD和相关疾病学会(NINDS-ADRDA)制定的“很可能AD”的诊断标准。有甲状腺功能低下、叶酸、维生素B12缺乏等代谢疾病；有脑梗死或脑出血(经MRI或CT证实)、抑郁症、癫痫、精神病、帕金森病等神经精神疾病者；有活动性消化溃疡，明显的肝、肾代谢和内分泌异常，明显的泌尿系梗阻和心血管疾病者，近期服用过降脂药及抗血小板聚集类药物的患者均被排除。

1.1.2 对照组 对照组来自同期体检中心的健康体检者，均经MMSE评分、蒙特利尔认知评估量表、Hachinski缺血评分证实无明显记忆障碍，无认知、社交及生活能力受损，无神经精神科疾病史，无神经系统变性病、无卒中史及痴呆家族史，近期未服用过降脂药及抗血小板聚集类药物。

1.1.3 该试验得到我院伦理委员会的批准，并且所有受试者或其家属均书面签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血小板的分离 空腹静脉抽取全血20 ml，柠檬酸钠抗凝。根据Colciaghi等[2]的方法并稍作改动，200×g室温离心15 min，小心抽取富含血小板的血浆层，2000×g室温离心15 min，弃上清。

1.2.2 霍乱毒素β亚基(CTB)标记 根据Blank等[3]的方法，将血小板(1×109)重悬于含有辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基(CTB-HRP)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，室温下轻摇1 h，然后用PBS将血小板洗涤两次，以洗除未结合的CTB-HRP。

1.2.3 血小板脂质筏的制备[4]将普通血小板(1×109)及CTB标记血小板(1×109)分别用1 ml 4 ℃预冷的裂解缓冲液(1% Triton x-100，25 mmol Mes，150 mmol Nacl，1×Protease inhibitor cocktail，pH 6.5)溶解，冰上裂解30 min。向细胞裂解物中加入2 ml 60%的Optiprep，使其终浓度为40%，将其放入超速离心管底部，上层依次覆盖30%、25%、5%、0%的Optiprep，200 000×g于4 ℃超速离心5 h，从上到下依次收集离心样品10份，每份约1 ml。

1.2.4 脂质筏的鉴定及点印迹定量法测定血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量 根据Shrimpton等[4]的方法，将离心后收集的10层样品点样于硝酸纤维素膜上，自然晾干，将此硝酸纤维素膜于含5%BSA的PBST中室温封闭1 h。倾去封闭液，加入含1 μg/ml辣根过氧化物酶标记的霍乱毒素β亚基的PBST，4 ℃孵育过夜。倾去孵育液，用PBS洗膜3次，每次10 min。加入1 ml混合ECL发光试剂盒中的液体，铺在LAS3000 mini化学发光成像仪中，采集图像。根据Tizon等[5]的方法，使用图像测量软件(Fuji,Japan) 分别测定每一样品GM1斑点的灰度，其灰度值代表GM1的表达水平。

1.2.5 血小板脂质筏内蛋白含量测定 采用BCA法，步骤严格参照Micro BCA Protein Assay Kit试剂盒(美国Pierce公司)提供的标准步骤进行。

1.2.6 血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量测定(比色法) 根据Blank等[3]的方法，对由CTB标记血小板分离获得的脂质筏内神经节苷脂GM1含量进行测定。在96孔酶标板的每孔加入75 μl待测样本和75 μl 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，室温避光30 min，加入125 μl终止液，于酶标仪波长450 nm处测吸光度值。根据标准曲线确定并计算待测样本的神经节苷脂GM1含量。

1.3 统计学分析 用GraghPad Prism 7.0软件对所得数据进行统计学处理，得出对照组与AD组血小板脂质筏内蛋白、神经节苷脂GM1含量的平均值和标准差。对照组及AD组性别构成进行卡方一致性检验，对照组与AD组年龄、受教育年限、MMSE评分、血小板脂质筏内蛋白及神经节苷脂GM1含量的比较采用t检验;对血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量与年龄、MMSE评分进行相关性分析，并定义P<0.05为显著性检验标准。

2 结 果

2.1 两组受试者的一般资料 AD组42例，男19例，女23例，平均年龄(65.88±1.88)岁;对照组45例，男21例，女24例，平均年龄(66.47±2.06)岁。两组在年龄、性别和受教育程度构成方面差异无统计学意义，具有可比性。AD组患者的MMSE评分与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)(见表1)。

2.2 脂质筏的鉴定 离心后，光照情况下在离心管内Optiprep 25%～30%交界面处可见一条白色的闪亮的环带，即脂质筏所在部位。点印迹法检测的结果(见图1)亦表明，仅第6层中含有GM1，说明脂质筏位于第6层中，与肉眼所见相符，处于25%～30%密度梯度离心界面的白色环带即在第6层中，因此第6层中的环带部分就是我们所需制备的脂质筏。

2.3 各组受试者血小板脂质筏内蛋白含量测定 结果显示，对照组、AD组血小板脂质筏内蛋白含量均值分别为(189.9±8.29)μg/ml 、(209.3±9.91)μg/ml，两组比较，AD组略高于对照组，但P=0.1494，差异没有统计学意义。

2.4 各组受试者血小板脂质筏内神经节苷脂GM1测定 应用比色法和免疫印迹定量两种方法对血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量进行测定，结果均显示，AD组明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.0001)(见图2)。

2.5 血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量与年龄、MMSE评分的相关性分析 血小板脂质筏内神经节苷脂GM1与年龄、MMSE评分无相关性，其相关系数分别为0.08895(P=0.4126)、0.2397(P=0.1263)。

表1 患者的一般资料

与对照组相比*P<0.01

图1 离心后收集的10层样品中各取10 μl，点样于硝酸纤维素膜上。应用点印迹法进行鉴定，仅第6份样品中含GM1，说明分布在第6份样品中的白色环带为脂质筏

图2 AD组与对照组血小板脂筏内神经节苷脂GM1含量情况

3 讨 论

自从1906年阿尔茨海默病被报道以来，便有许多学者致力于AD的研究。虽然目前其确切病因和发病机制尚不清楚，但作为老年斑的主要成份-Aβ在脑组织中的大量沉积被认为是AD病理机制的核心所在，而且是AD最早、最特征性的改变，是AD发病的关键环节。

Aβ由一种跨膜糖蛋白-淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解产生。在Aβ的N末端和C末端分别由β和γ分泌酶水解APP，产生完整的Aβ片段。在正常情况下，这并不是主要的代谢途径，而是由α分泌酶切割后产生的含部分Aβ片段的分泌性APP(APPs)和C末端片段。某些因素使APP基因过表达导致APP生成增加，APP基因在α、β和γ分泌酶作用位点附近的突变，促进β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。

脂质筏概念由Brown and Rose在1992年提出[6]，其为膜脂双层内含有特殊脂质和蛋白的微区，富含胆固醇和鞘脂[7]。脂筏具有在4 ℃时不溶于非离子去垢剂这一特征，筏内的特异蛋白亦不溶于这些洗涤剂，利用这一特性，传统采用Triton x-100裂解细胞，然后利用蔗糖密度梯度离心法将脂质筏分离[8]。而霍乱毒素B亚基(CTB)，因其与脂质筏成分之一神经节苷酯GM1特异性结合，目前广泛应用于检测脂质筏[8]。脂质筏参与许多细胞过程，如信号转导、病原体入侵、蛋白质和脂质的胞吞和细胞内运输、神经退行性疾病、血管生成等[7,9,10]。目前研究认为脂质筏在AD的发病机制中起重要作用。神经元质膜的脂质筏是保持在维系神经细胞学习及记忆功能等方面起重要作用的树突和突触的稳定性所必需的[11]。研究表明，与其它类型的细胞相比，作为正常大脑记忆中枢的成熟的海马神经元内的脂质筏更为丰富，进一步阐明在AD的发病过程中，海马神经元是Aβ寡聚体损害及破坏的最初靶点[12]。脂质筏参与Aβ低聚体介导的AD神经病理发生及发展的3个过程：(1)Aβ的生成；(2)Aβ聚集形成低聚体；(3)Aβ低聚体与神经元上的受体相结合而致病，这些均在质膜的脂质筏微区内进行[13,14]。

目前大量研究表明，脂质筏及其内神经节苷脂GM1在AD的Aβ生成过程中起重要作用。首先，Aβ的产生依赖于脂质筏，APP经淀粉样蛋白生成途径的降解在脂质筏区进行，而经非淀粉样蛋白生成途径的降解在非脂质筏区进行[13]。Ehehalt等利用交联抗体使APP与BACE在细胞膜上的脂质筏内交联，之后Aβ的生成量明显增加，但是当脂质筏结构破坏时，Aβ的生成量无变化[15]。Cordy等研究发现BACE1(β分泌酶)由非脂质筏区移位至脂质筏区后，sAPPβ及Aβ的产量上调[16]。Williamson等在从AD患者脑组织中分离的脂质筏中发现大量的Aβ、磷酸化tau蛋白，以及APP、Aβs、BACE1和γ分泌酶等肽酶片段[17]。可见，脂质筏的存在及其结构的完整性是Aβ生成所必需的，BACE1的活性与脂质筏结构密切相关，Aβ的生成过程主要发生在脂质筏内。

其次，神经节苷脂GM1促进Aβ的生成。神经节苷脂GM1含量的改变能够影响APP的水解过程，Zha等发现，外源性神经节苷脂GM1可抑制其α分泌酶活性，并促进γ分泌酶活性进而使Aβ的生成量增加10倍。相反，应用葡糖神经酰胺合成酶抑制剂处理HEK293或HeLa细胞后，细胞内神经节苷脂GM1的水平显著下降，使Aβ生成减少[17]。Yamamoto[18]等研究发现，当通过瘦素诱导神经元脂质筏内神经节苷脂GM1的表达下降达60%时，可完全阻止Aβ的生成。以上研究结果均表明，脂质筏内神经节苷脂GM1含量的增加是导致Aβ的生成的重要原因。

再者，神经节苷脂GM1促进Aβ的聚集。神经节苷脂GM1可使Aβ的构象发生改变，并与Aβ结合形成神经节苷脂GM1结合Aβ，即GAβ，是AD早期的病理改变[19]，GAβ如同“种子”一样启动并加速Aβ的聚集[20,21]。对AD患者的脑组织进行免疫组化研究时，在老年斑内发现GAβ也支持以上观点[17]。神经节苷脂GM1与Aβ结合，即GAβ的生成发生在老年斑形成之前，在早期AD患者脑内，GAβ存在于皮质神经纤维网内，而不是老年斑中[22]。Hong等[22]在存活的AD患者的脑脊液内检测到GAβ，可见GAβ存在脑组织内，并有少量进入脑脊液内。Kim等从富含神经节苷脂GM1的鼠脑中分离获得的脂质筏具有促进Aβ聚集的功能，并且当去除这些脂质筏内的胆固醇或蛋白后，其对Aβ聚集的促进作用并未受到影响[23]。用CTB阻断神经节苷脂GM1上Aβ结合的特异性位点，可消除由Aβ低聚体导致的海马长时程增强效应(LTP)受损，说明神经节苷脂GM1和Aβ结合可能是导致下游Aβ对突触毒性作用的关键步骤[22]。因此，神经节苷脂GM1具有促进Aβ聚集的作用，GAβ的生成可能是Aβ聚集致病的始动因素。

Martin等研究发现，从AD患者脑组织内分离获得的脂质筏的构成存在异常，与对照组相比，其更具粘性及有序性[16]。Molander-Melin等[24]对AD患者额叶脑组织脂质筏内成分的分析发现GM1，GM2明显高于对照组，而胆固醇及蛋白水平与对照组相比无明显差异。Pernbert等[25]对AD患者脑组织的研究同样发现额、颞叶皮质脂质筏内GM1和GM2含量增加，并与毒性淀粉样纤维形成有关。由于目前很难在AD患者存活的情况下获取脑细胞进行分析，而血小板的生物化学和药理作用方面类似于神经元，90%的血源性可溶性Aβ由血小板产生，血小板中含有完整的裂解APP的酶系：α、β、γ分泌酶[26]，血小板中的APP异构体浓度与脑中APP异构体浓度相当[27]，血小板可能反映了AD疾病中神经元的发病机制。因此血小板常作为AD研究的外周模式系统，我们选择使用血小板的生化参数来探索可作为诊断AD的外周生物学标志物。

在血小板脂质筏制备中，之前的研究均使用蔗糖作为梯度离心的介质，需要200 000～280 000g离心18 h～24 h以上。本研究中，我们尝试用Optiprep代替蔗糖作为梯度离心的介质，Optiprep是最新研究出的全能型分离液，主要成份为iodixanol，是一种高亲水性非离子物质，具高密度、低粘度的特点，离心过程只需要5 h，大大减少了脂质筏的制备时间。之后，我们检测了临床诊断为AD的42例患者外周血血小板脂质筏内神经节苷脂GM1及蛋白的水平，同时与45例智能正常老年人外周血血小板脂质筏内相关成分检测结果进行对照研究。我们发现，AD患者外周血血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量明显高于对照组(P<0.0001)，而脂质筏内蛋白含量与对照组相比无明显差异(P=0.1494)。由于本研究的样本量相对较少，所以在后续的研究中，将进一步扩大样本量进行验证，以便确认血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量异常与AD之间是否真正存在相关性。

综上所述，本研究结果显示AD患者外周血血小板脂质筏内神经节苷脂GM1水平明显升高，血小板脂质筏内神经节苷脂GM1含量可能作为AD的一种潜在生物标志物，并且可能为今后干预治疗提供一定的帮助。

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Study on the ganglioside GM1 content of lipid rafts in platelets of patients with Alzheimer’s disease

LIU Li,ZHANG Ke,WANG Jinchun,et al.

(Department of Neurology,Shenyang Fifth People Hospital,Shengyang 110023,China)

Objective To investigate the changes of ganglioside GM1 of lipid raft in platelets in patients with Alzheimer’s disease (AD),in order to find an early biomarker for diagnosis of AD.Methods The neurological functions of 42 patients with AD and 45 subjects with normal cognition were evaluated by neuropsychological examinations.Lipid raft was isolated by Optiprep gradient centrifugation and identified by dot blotting.The protein content was measured by using BCA assay,ganglioside GM1 content using colorimetry and dot blotting analysis.Results A white light-scattering band under light illumination located at interface between 25%～30% Optiprep was detectable,which was revealed by dot-blotting.The lipid raft fraction floats within Optiprep gradient fraction 6.The platelet lever of protein in lipid raft was slightly higher in AD group than that in the control group,but there was no statistically significant difference between the two groups (P=0.1494).The platelet lever of ganglioside GM1 in lipid raft was statistically significantly higher in the AD group than that in the control group (P<0.01),but it was not significantly correlated with the age and the scores of MMSE.Conclusion As compared with normal mental state control,the ganglioside GM1 in lipid raft of the platelets in AD group was significantly increased,which may be associated with AD.The altered ganglioside GM1 in lipid raft of the platelets,probably an early biomarker of AD,is of potential value in clinical diagnosis of AD.

Alzheimer’s disease (AD)； Lipid raft； β-amyloid protein； Ganglioside GM1

2017-04-02；

2017-05-30

沈阳市科技计划项目(F16-206-9-27)

(1.沈阳市第五人民医院神经内科，辽宁 沈阳 110023；2. 中国医科大学发育细胞生物学教研室，辽宁 沈阳 110013；3.中国医科大学第一附属医院神经内科，辽宁 沈阳 110001)

曹云鹏，E-mail：ypengcao@sina.cn

1003-2754(2017)08-0687-05

R749.1

A