羊链球菌病灭活疫苗生产工艺研究

礼 颖，秦立鑫

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

羊链球菌病灭活疫苗生产工艺研究

礼 颖，秦立鑫

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

目前羊链球菌病作为羊场发病的一种新型病引起广泛关注，因此该病疫苗的制备受到生物制品企业的重视。文章对羊链球菌病灭活疫苗的生产工艺进行研究。

羊链球菌病；生产工艺；灭活疫苗

羊链球菌病是严重危害山羊、绵羊的疫病，是由溶血性链球菌引起的一种急性热性传染病。此病主要通过消化道和吸呼道传染，链球菌最易侵害的是绵羊，山羊也很容易感染，多在羊只体况比较弱的冬春季节呈现地方性流行[1-7]。目前羊链球菌病作为羊场发病的一种新型病引起广泛关注，因此该病疫苗的制备受到生物制品企业的重视，本文对羊链球菌病灭活疫苗的生产工艺进行研究。

1 试验材料与动物

生产用种子制造和检验本品用的菌种为羊链球菌C55001和C55002菌株，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。“岳1系”或“St.0.6”菌株，分别暂由新疆生物药品厂和四川生物药品厂鉴定、保管和供应。培养基包括缓冲肉汤琼脂、缓冲肉汤、40%葡萄糖溶液、酪胨琼脂斜面（G.A）、硫乙醇酸盐酪胨汤（T.G）葡萄糖蛋白胨（G.P）。试验动物为大耳白家兔、绵羊，由动物实验室提供。

2 菌种制备

2.1 基础种子

羊链球菌C55001和C55002菌株冻干菌种用灭菌2～5 mL pH 7.6缓冲肉汤分别进行溶解，接种未经免疫的绵羊，3～5 d采取发病而死的绵羊心血，制备基础菌种，-15℃保存1年。

2.2 生产用种子制备

一级种子繁殖及鉴定：取低温保存的2～3株死羊血菌种，分别接种于血液琼脂大管斜面上，37℃培养16～20 h，取样接种血液琼脂斜面和厌气肉干汤，纯粹检验合格后，作为一级种子。在2～8℃保存，每周移植1次，使用期≤1个月。在培养基上继代，不超过4代。

二级种子繁殖：用缓冲肉汤分别洗下各株一级种子，混合接种于缓冲肉汤中，37℃培养16～20 h，经纯检合格后，置2～8℃保存≤4 d。

2.3 制苗用菌液制备

2.3.1 菌液培养

将缓冲肉汤置37℃预热24 h后，按培养基量的0.2%加入葡萄糖（制成50%溶液），也可同时按总量的1%～2%加入血清或血红素，并按总量的5%接入二级种子液，37℃培养18～24 h，培养期间摇瓶3次。

2.3.2 纯粹检验

从大瓶菌液中取样，接种于血液琼脂斜面、马丁肉汤和厌气肉干汤，37℃培养24 h后进行检查，并经镜检纯粹后方可配苗。

2.3.3 活菌计数

用含10%绵羊脱纤血（或血清）琼脂平板进行计数。

2.3.4 灭活

按菌液总量的0.3%加入甲醛溶液，充分振荡后，置37℃灭活16～24 h，期间摇瓶2～3次。

2.3.5 灭活检验

将菌液接种于血液琼脂斜面，37℃培养48 h，应无菌生长。

2.3.6 无菌检验

将待测样品接种TG小瓶（50 mL·瓶-1），接种量为1.0 mL·瓶-1，置37℃培养，3 d后吸取培养物，分别接种GA斜面、TG小管各2支和GP小管1支，接种量为0.2 mL·支-1，一支GA斜面和TG小管置37℃培养，一支GA斜面、TG小管和GP小管置25℃培养，均培养5 d，每日观察结果并记录。

2.4 配苗

检验合格后，按菌液5份加灭菌氢氧化铝胶1份进行配苗。经充分振荡后于冷暗处保存，制备成6个批次产品。

2.5 安全检验

用体重1.5～2.0 kg家兔2只，各皮下注射疫苗3.0 mL，观察10 d。

2.6 效力检验

用1～3岁健康易感绵羊4只，各皮下注射疫苗5.0 mL，21日后连同条件相同的对照羊3只，各静脉注射致死量羊链球菌强毒，观察21～30日，对照羊全部死亡，免疫羊至少保护3只；或对照羊死亡2只，免疫羊全保护为合格。

3 试验结果

各批次培养时间及培养菌数对比见表1，灭活检验情况见表2，无菌检验结果见表3，安检情况见表4，效力检验情况见表5。

表1 各批次培养时间及培养菌数对比表

表2 灭活检验情况

通过表1各批次培养时间与菌数情况，可知18～26 h期间菌数为逐渐递增，到达28 h时，开始有大量菌体死亡，进入衰亡期。由表2与表3可见，各批次相应的灭活检验及无菌检验均达到要求，为安全检验与效力检验做好保障。由表4可知，各批次安全检验均达到要求。由表5可知，201501、201502、201505、201506效力均未达到要求，为不合格，201503与201504效力达到要求。

表3 无菌检验结果

表4 安检情况

表5 效力检验情况

4 结 论

201505批培养时间为26h，培养菌数28亿个·mL-1，效力检测中未能达标；201503批培养时间为22h，培养菌数18亿个·mL-1，但其效力检测结果达到标准线；201504批培养时间为24h，培养菌数为22亿个·mL-1，其效力检测结果良好。说明在培养时间范围之内，菌数达到约20亿个·mL-1免疫效果最好。

[1] 王保仙.羊链球菌病的诊断与预防措施[J].当代畜牧,2015（3）:56-57.

[2] 才木德,娜尔力玛.羊链球菌病的诊断[J].畜牧与饲料科学,2001,22（3）:42.

[3] 单细法,冯利华.羊链球菌病的诊断与防治[J].当代畜牧,2015（35）:83-84.

[4] 赵万军,胡鹏,蒲新竹,等.绵羊链球菌病的诊断与防治[J].甘肃畜牧兽医,2015,45（6）:50.

[5] 韩涛,陈世军,沈辰峰,等.羊链球菌病的诊治[J].现代农业科技,2015（20）:238-239.

[6] 李军成,路彩霞,冯国庭.羊链球菌的综合防治[J].中国兽医杂志,2009,45（3）:69-70.

[7] 栾海涛.羊链球菌病的诊断与防治措施[J].养殖技术顾问,2013（5）:101.

Study on the Production Technology of Inactivated Vaccine Against Sheep Streptococcus Disease

LI Ying,QIN Lixin
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

At present,the sheep streptococcal disease as a new disease caused widespread concern,so the dis⁃ease vaccine was prepared by biological products enterprises.This paper researched on the production process of sheep streptococcal disease inactivated vaccine.

sheep streptococcus disease;production process;inactivated vaccine

S826；S852.61+1

A

1001-0084（2017）08-0043-04

2017-06-22

礼颖（1974-），女，辽宁辽中人，兽医师，主要从事疫苗生产的研究与应用。