鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂的研究

李洪艳，赵 刚

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂的研究

李洪艳，赵 刚

（哈药集团生物疫苗有限公司，哈尔滨 150069）

佐剂与抗原混合后注射动物体内，能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用。凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均可称为佐剂。目前新城疫灭活疫苗的佐剂免疫增强效果不理想，亟待开发一种适用于鸡新城疫灭活疫苗的免疫佐剂。试验对鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂进行研究，结果表明，佐剂溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最优，且用此佐剂制成的鸡新城疫灭活疫苗，疫苗免疫效果明显提高。

免疫佐剂；鸡新城疫灭活疫苗；制备

免疫佐剂其功能是与抗原混合后注射于动物体内，能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用。佐剂的种类非常多，常规佐剂包括铝盐类、油乳剂、蜂胶佐剂。最常见的佐剂为油类佐剂，这类佐剂通常具有良好的免疫增强作用。但是，目前新城疫灭活疫苗的佐剂免疫增强效果不理想，亟待开发一种适用于鸡新城疫灭活疫苗的免疫佐剂[1-5]。本文对鸡新城疫灭活疫苗免疫佐剂进行系统的研究，为制备高效的鸡新城灭活疫苗奠定基础。

1 试验材料与动物

新城疫病毒La Sota株，购自中国兽药监察所，HA效价为28，-20℃保存备用；盐酸左旋咪唑注射液，白油佐剂购自美国索诺邦公司；30日龄SPF鸡，整个饲养过程均在公司生产的隔离器中进行，饲料经高压灭菌，水为酸化水。采血用试验鸡为成年SPF公鸡。

2 试验方法

2.1 佐剂的制备

高浓度母液的配制：用市售的左旋咪唑含量为50 mg·mL-1的兽用盐酸左旋咪唑注射液作为左旋咪唑母液，将其过滤除菌后备用。配制低浓度佐剂溶液：取50 mg·mL-1的左旋咪唑母液4 mL与白油佐剂96 mL混合均匀，即为每mL溶液中含有左旋咪唑为2 mg的疫苗佐剂。

2.2 佐剂组分筛选试验

A组左旋咪唑与弗氏佐剂；B组左旋咪唑与皂苷；C组左旋咪唑与白油；D组白油与卡波姆（树脂）；E组白油与黄芪多糖。

试验数据表明，C组（即左旋咪唑与白油组成的佐剂）的效果最好，表明这两种成分有协同增效作用。

表1 不同佐剂接种后动物的临床反应

表2 免疫后HI效价检测结果

2.3 鸡新城疫灭活疫苗的制备

2.3.1 新城疫病毒在鸡胚上增殖

将新城疫病毒La Sota株用灭菌生理盐水分别各作10～5倍稀释，各接种9～10日龄SPF胚10枚，0.1 mL·枚-1，接种后密封针孔，置于37℃继续孵育，不必翻蛋，每天照胚2～3次。将在48 h前死亡的鸡胚弃去，48 h后，每4～8 h照胚1次，死亡的鸡胚随时取出，直至120 h，不论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却。将冷却4～24 h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术去除拟定部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛屑囊膜及羊膜，收集48～120 h死亡和120 h后的活胚的尿囊液，单胚单收，并分别测定每胚的HA效价及混合后原液的EID50。

2.3.2 新城疫灭活疫苗的制备

将灭活并检验合格的鸡胚尿囊液混于同一容器内，先加入5%体积的吐温-80，充分摇匀，至吐温-80完全融解；再按l∶1.5体积分别加入本试验实施例1至3制备的佐剂或者加入白油佐剂，充分乳化后，取1支洁净吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，不扩散，判为合格。充分摇匀后，定量分装，置2～8℃备用。

2.3.3 新城疫灭活疫苗安全性试验

用10～14日龄SPF鸡10只，颈部皮下接种新城疫灭活疫苗1.0 mL，观察14 d，应不出现由疫苗引起的任何局部或全身反应。

2.4 动物免疫效果试验

为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，将经SPF鸡胚扩增的病毒液与含不同浓度左旋咪唑的白油佐剂，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同剂量0.02 mL·只-1，免疫方式为颈部皮下注射，观察免疫及保护效果。

试验动物分组：A-表示胚毒与实施例1制备的每mL溶液中含2 mg左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组；B-表示胚毒与实施例2制备的每mL溶液中含5 mg左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组；C-表示胚毒与实施例3制备的每mL溶液中含10 mg左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组；D-表示胚毒与不含左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组；NC-空白对照组。每组10只SPF鸡，同时留5只不免疫作为对照组。免疫前采血，HI抗体检测均为阴性。分别在免疫后第7、14、21天翅下静脉采血，分离血清，用HI方法测定血清抗体效价。

2.4.1 免疫鸡淋巴细胞增殖试验

试验期间每周每组随机剖杀2只鸡，取脾做淋巴细胞增殖试验，以特异性全病毒蛋白刺激脾淋巴细胞，观察淋巴细胞增殖情况。淋巴细胞增殖试验参照淋巴细胞增殖试验CCK-8试剂盒说明书进行。

鸡脾淋巴细胞的制备：取SPF鸡静脉注射空气处死后，放入70%酒精中浸泡5 min；之后无菌手术开腹，取出脾脏，放于加有不完全RPMI-1640培养基的平皿中；将脾脏剪碎放在铜网上，用注射器针芯挤压研磨脾脏；取出铜网，反复吹吸几次后，将脾细胞悬液转移到50 mL离心管中，加不完全培养液至30 mL，混匀，1 500 r·min-1、4℃离心6 min，弃上清；然后向细胞沉淀中加入10 mL红细胞裂解液，重悬，37℃裂解5 min后，1 500 r·min-1、4℃离心6 min，弃上清；细胞沉淀用10 mL含3%血清的Hank's液洗涤2次；用RPMI-1640完全培养液将制备好的脾淋巴细胞悬液调整至2×106个·mL-1后，加至96孔细胞培养板中，每孔200 μL。每只鸡脾淋巴细胞分别设9孔，其中3孔加入20 μL纯化的新城疫病毒作为特异性刺激抗原作为试验孔，终浓度为5 μg·mL-1；3孔不加入任何刺激抗原作为细胞增殖的本底对照，3孔加入终浓度为20 μg·mL-1的刀豆球蛋白A（ConA）作为阳性对照；37℃5%CO2培养箱内培养60 h；加入10 μL的CCK-8试剂后继续培养4 h，于450 nm波长测量各孔的吸光度，计算刺激指数。

刺激指数（SI）=试验组OD均值/相应本底OD均值。

2.4.2 鸡γ干扰素检测

取制备好的脾淋巴细胞悬液加至6孔细胞培养板中，每孔3 mL。37℃、5%CO2培养箱内培养5 d后移取细胞悬液，3 000 r·min-1离心10 min，收集上清液，4℃暂存备用。采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）检测鸡γ干扰素（IFN-γ），具体操作按鸡IFN-γELISA检测试剂盒使用说明书进行。向预先包被IFN-γ抗体的包被微孔中依次加入样品、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤后用底物TMB显色。颜色的深浅和样品中的IFN-γ呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算样品浓度。

IFN-γ检测操作步骤：从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃；设置标准品孔、样本孔、空白孔。标准品孔各加浓度为0、5、10、20、40、80 pg · mL-1的标准品50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL（样品最终稀释度为5倍），空白孔不加；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μL，用封板膜封板后置37℃恒温箱温育60 min；小心揭掉封板膜，弃去液体，吸水纸上甩干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上甩干，如此重复洗板5次；每孔先加入底物A 50 μL，再加入底物B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光孵育15 min；每孔加终止液50 μL，终止反应，15 min内在450 nm波长下测量各孔的吸光度；在Excel工作表中，以标准品的浓度为横坐标，对应OD450nm值为纵坐标，绘出标准品线性回归曲线，计算出标准曲线的直线回归方程式；将样品的OD450nm值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以总稀释倍数（×n×5），即为样品的实际浓度。

3 试验结果

3.1 新城疫病毒的效价测定

经测定，新城疫病毒EID50为108.3/0.1 mL＞108.0/0.1 mL，HA为29，符合制苗要求。

3.2 免疫效果检测

不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平见表3。

疫苗免疫后，鸡群外观、食欲均正常，无不良反应，接种部位无红肿现象，吸收效果良好，表明含左旋咪唑的鸡新城疫灭活疫苗对鸡只安全。血清抗体效价结果表明，添加不同浓度左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组的HI抗体平均水平均明显高于不含左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组和空白对照组。

表3 不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平

3.3 免疫鸡淋巴细胞增殖试验

淋巴细胞增殖试验结果见表4。由表4结果可知，添加不同浓度左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组的淋巴细胞数均高于不含左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组和空白对照组；含5或10 mg左旋咪唑的白油佐剂制备疫苗免疫组的淋巴细胞数显著高于其他组（P＜0.05）。表明左旋咪唑可促进鸡淋巴细胞增殖，刺激机体产生较强的细胞免疫。

表4 鸡免疫后脾淋巴细胞增殖反应

3.4 干扰素检测

IFN-γ标准曲线的直线回归方程式为：y=0.0156x R2=0.9885。换算出不同ND疫苗免疫后各组脾淋巴细胞中IFN-γ含量，结果见表5。

表5 免疫后各组脾淋巴细胞中IFN-γ含量 pg ·mL-1

表5结果表明，含左旋咪唑5或10 mg的白油佐剂制备疫苗免疫组的脾淋巴细胞中IFN-γ含量均明显高于其它免疫组；含左旋咪唑10 mg的白油佐剂制备疫苗免疫组的脾淋巴细胞中IFN-γ含量最高。表明左旋咪唑可增强鸡新城疫灭活疫苗的免疫功能，延长疫苗免疫保护期。

4 结论

将左旋咪唑与白油佐剂按照不同用量配比制成的佐剂，通过试验数据表明，只有佐剂溶液中含有左旋咪唑2～10 mg·mL-1的用量配比效果最优，且用此佐剂制成的鸡新城疫灭活疫苗，疫苗免疫效果明显提高，为制备高效的鸡新城灭活疫苗奠定了基础。

[1] 梁华丽,华炯钢,徐辉,等.几种鸡新城疫油佐剂灭活疫苗免疫效果的比较[J].浙江农业学报,2007,19（6）:418-422.

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Study on Immune Adjuvant Inactivated Newcastle Disease Vaccine

LI Hongyan,ZHAO Gang
（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Adjuvant mixed with antigens after injection in the animal,can enhance the body or non-specific changes of specific immune response to the antigen,play its supporting role.Any substance that enhances the antigenspecific immune response can be called an adjuvant.However,current adjuvant Newcastle disease inactivated vac⁃cine enhancement effect is not ideal,the need to develop a suitable Newcastle disease inactivated vaccine adjuvant.The paper studied the immune adjuvant of chicken Newcastle disease inactivated vaccine,the result showed that the best content of levamisole in a adjuvant solution was 2～10 mg· mL-1.Newcastle disease inactivated vaccine which was made with this adjuvant could increase vaccine immunization effect obviously.

adjuvant;newcastle disease inactivated vaccine;preparation

S831；S852.65+9.5

A

1001-0084（2017）08-0039-04

2017-06-03

李洪艳（1978-），女，辽宁建平人，兽医师，主要从事于疫苗生产。