大连市天竺葵叶斑病病情调查及病原菌鉴定初报*

王 晶，菅盼盼

（1.大连森林动物园，辽宁大连 116013； 2.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116081）

大连市天竺葵叶斑病病情调查及病原菌鉴定初报*

王 晶1，菅盼盼2

（1.大连森林动物园，辽宁大连 116013； 2.辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116081）

天竺葵（Pelargonium hortorum）具有较高的观赏价值和药用价值，是城市园林中常见的草本花卉。近几年，大连市园林中的天竺葵叶斑病发生较重，查明病因、为病害防治提供理论依据尤为重要。采用单斑分离、致病性检测、形态学及分子生物学鉴定，查明了大连市天竺葵叶斑病的病原是两种真菌：枝顶孢属的点枝顶孢（Acremonium alternatum）和链格孢属的致密链格孢（Alternaria compacta）。点枝顶孢侵染天竺葵，导致其发生叶斑病鲜有报道。

天竺葵；叶斑病；病原菌鉴定

天竺葵（Pelargonium hortorum），属于多年生草本花卉，世界各地均有种植。其花色艳丽、花期长、产花量大、适应性强，具有较高的观赏价值。园林中主要用于盆栽观赏，可室内盆栽，也可盆栽后用于花坛、庭院布置，也是很好的插花和干花材料。某些天竺葵可清除空气中的苯、甲苯等有害物质［1］、释放特殊香气［2］，具有驱蚊作用［3］，可以提取精油入药［4～6］或作为香料［7］，也是一种理想的天然色素原料［8］。近年来大连市区天竺葵叶片发生了较为严重的叶斑病，查明其发病原因，为其病害防治提供理论依据成为当务之急。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病源

于辽宁省大连市森林动物园、劳动公园和西郊生物园，采集天竺葵发病植株的感病叶片，同时采集健康植株叶片作对照。

1.1.2 试剂与培养基

DNA Marker（DL2000）、dNTP、TaqDNA聚合酶、buffer等试剂购于大连 TaKaRa公司；引物（its1和 its4）由上海生工合成；引物合成、DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；马铃薯琼脂培养基（PDA）等。

1.1.3 仪器

灭菌器（YM100Z）、超净工作台（YJ－875）、恒温培养箱（HH.B11）、光学显微镜（OLYMPUS，CX21）、PCR仪（GeneAMP 9700）、凝胶成像系统（GDS8000）等。

1.2 方法

1.2.1 病害调查及症状观察

于2016年6～10月，选取大连市森林动物园、劳动公园和西郊生物园三地为病害调查区，采用五点取样法在每调查区随机选5点、每点选7株。从发病初期每隔10 d观察一次，统计叶斑病发病率及病情指数［9］。

1.2.2 病原菌的分离与纯化

采用单斑分离法［10］，在病斑的病健交接处剪取约5 mm×5 mm大小的病组织块，经酒精、无菌水表面消毒约2min后，置于PDA培养基中28℃下恒温培养，3～4 d后观察菌落生长状况，计算单斑分离率。再以接种针挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中28℃下恒温培养，重复操作至分离菌纯化。

1.2.3 分离菌致病性测定

采用针刺法，依据科赫氏法则进行分离菌的致病性检测［9］。每处理接种5片叶，3次重复。

1.2.4 病原菌鉴定

1.2.4.1 形态学鉴定

肉眼观察菌落特征，菌落正反面颜色、轮纹等；光镜下观察菌丝及孢子特征，分生孢子的大小、形状、孢子梗的有无及膈膜等［10］。

1.2.4.2 分子生物学鉴定

以钢珠法［11］提取致病菌DNA，以琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，以真菌通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）对致病菌rDNA-ITS区进行PCR扩增。PCR扩增产物送至上海生工生物工程公司进行DNA测序。最后，将测得的DNA序列在 NCBI网站进行 blast比对，利用ClustalX软件将测得序列与已报道的相近植物病原菌的序列进行序列对齐和同源性序列的多重排定，用 MEGA5.0软件进行序列分析，邻近法（Neighbor-Joining）构建分子系统发育树。

2 结果与分析

2.1 病情调查及症状观察

2.1.1 病情调查

6月中旬植株开始发病，8月初至9月中旬病害发展迅速，为发病盛期，10月份病叶枯萎或枯死。

表1 天竺葵叶斑病发病率及病情指数Table1 Incidence and disease index of Geranium Leaf spot disease

2.2.1 症状观察

天竺葵发病部位为叶片，发病初期感病部位褪绿变黄，逐渐形成枯斑，最终形成穿孔，病健交接处有明显的晕圈。随着病情的蔓延，叶片整片枯死，发病叶片大多呈现多个病斑，病斑在叶片上分布无规律性。病斑排列不规则，有纶纹。叶脉、叶片边缘处均可见病斑（图1）。

图1 天竺葵叶斑病症状Figure 1 Symptoms of Geranium leaf spot

2.2 单斑分离率

从天竺葵感病叶片单斑分离出3种不同菌落形态的真菌，分别命名为E1、E2和E3，他们的单斑分离率分别为46%、40%和14%，对照健康组叶片均无真菌菌落生长。依据单斑分离率的多少，初步推断导致天竺葵叶斑病的主要病原菌可能是E1和E2。

2.3 分离菌的致病性检测

以针刺法分别接种3株真菌，E1和 E2可使天竺葵的健康叶片发病，发病率分别为100%和97.8%，而接种E3的健康叶片未见发病；又将接种发病的2株菌E1和E2进行混合菌株接种处理，其发病率是100%。对天竺葵接种发病叶片重新进行单斑分离、鉴定，其分离菌与接种菌的菌落及分生孢子形态一致。由此可以断定E1和E2具有侵染性，是天竺葵叶斑病的致病菌。

2.4 病原菌鉴定

2.4.1 形态学鉴定

病原菌E1：在PDA培养基上28℃培养6 d后，菌落直径为43 mm。菌落正面为白色至淡粉色，无轮纹，菌丝初期紧凑而湿润，菌丝细并透明，匍匐生长，菌落反面为淡粉黄色；分生孢子透明，单细胞，倒卵圆形或圆柱状，分生孢子大小约4.2～5.0×1.5～2.0μm（图2）。

病原菌E2：在PDA培养基上28℃培养6d后，菌落直径为48mm。菌落正面为墨绿色、有轮纹，菌落表面湿润，菌落反面为墨绿色至黑色；分生孢子梗直立，分生孢子大多数倒梨形、近卵状或倒棒状，黄褐色至褐色，具有横隔3～7个，纵、斜隔膜0～4个；分生孢子大小为24.4～48.9μm×7.3～12.2μm，喙及假喙柱状，淡褐色至近无色，部分假喙延伸较长，2.4～14.7μm×2.4～4.9 μm（图3）。

依据分离菌株的形态结构，其形态学鉴定结果为：E1为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、淡色菌科（Moniliaceae）、枝顶孢属（Acremoniumsp.）的点枝顶孢（Acremonium alternatum）；E2为半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、暗色菌科（Dematiaceae）、链格孢属（Alternaria）的致密链格孢（Alternaria compacta）。

2.4.2 分子生物学鉴定

两种致病菌 DNA，以引物 ITS1和 ITS2经PCR扩增后，电泳检测在500 bp左右处，可见DNA纯度及浓度较高的特异性条带。PCR扩增产物测序结果显示，E1序列长度为548 bp，E2序列长度为531 bp。将此序列在NCBI网站上进行Blast比对，其结果显示：E1与点枝顶孢（Acremonium strictum）的相似度为99%，所得分值为964；E2与致密链格孢（Alternaria compacta）的相似度99%，所得分值最大，为982。分子生物学鉴定结果进一步确证了形态学鉴定结果的正确。构建的系统进化树如图4和图5。

图2 菌株E1的菌落特征及分生孢子形态Figure 2 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen E1

图3 菌株E2的菌落特征及分生孢子形态Figure 3 Colony morphologies and conidial shape of the pathogen E2

图4 菌株E1的rDNA-ITS系统进化树Figure 4 Neighbor-joining tree constructed from E1 ITS sequences

图5 菌株E2的rDNA-ITS系统进化树Figure 5 Neighbor-joining tree constructed from E2 ITS sequences

3 结论与讨论

任何植物，在整个生长发育过程中，都容易受到各种病原菌的危害。天竺葵的病害主要为叶部病害，有：褐斑病、叶斑病、灰霉病、花腐病、黄萎病、冠腐病，其致病菌分别是天竺葵链格孢（Alternaria pelargoniiEll.et EV）、链格孢（Alternaria tenuisNees）、灰葡萄孢（Botrytis cinereaPers.）、天竺葵葡萄孢（Botrytis pelargoniiRoed）、轮枝霉（Verticillium albo-atruminkeReinke et Berth.）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）。本研究结果表明，大连市天竺葵叶斑病的病原菌是点枝顶孢（Acremonium alternatum）和致密链格孢（Alternaria compacta）。链格孢菌寄主广泛［12］，可导致不同花卉及农作物发生病害，但点枝顶孢侵染天竺葵导致其发生叶斑病鲜有报道。明确大连市天竺葵叶斑病的病原菌对于该病的防治尤为重要，可以选择对环境友好的苯醚甲环唑、代森锰锌等化学杀菌剂，也为筛选病原菌的拮抗菌研制生物农药提供了参考。20世纪70～80年代，生物农药逐渐走入人们的视野，随着技术的发展以及安全意识的提高渐渐受到人们的重视，并以高选择性、高安全性以及低生态影响性等成为植保专家学者、工作者的重要研究课题之一。

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Preliminary Report on the Investigation and Identification of Geranium Leaf Spot Pathogens

WANG Jing1，JIAN Pan-pan2
（1．Dalian Forest Zoo，Dalian，Liaoning 116013； 2．College of Life Science，Liaoning Normal University，Dalian，Liaoning 116081）

Geranium（Pelargonium hortorum）is a common herbaceous flower in urban landscape with a high ornamental and medicinal value.In recent years，serious leaf spot appears in Geranium of Dalian.Therefore，it is imperative to find out the pathogenesis and provide theoretical basis for the disease prevention.To identify the pathogens of the leaf spotof Geranium，severalmethodswere used such as isolation pathogens from the leaf spot sample，pathogenicity determination of the isolated strain，morphological and molecular biological evaluation，etc.The results show thatAcremonium alternatumandAlternaria compactaare two kinds of pathogens that lead to the Geranium leaf spot in Dalian.So far，Acremonium alternatumof the Geranium leaf disease is rarely reported.

Geranium；Leaf spot；Pathogen identification

S682.1＋62.01

B

1002－1728（2017）04－0039－05

10.3969／j.issn.1002－1728.2017.04.009

2017－07－14

王晶（1970－），女，从事园林绿化工作。

菅盼盼（1991－），女，研究生（在读）。