SELDI-TOF-MS蛋白指纹图谱技术在筛选肺腺癌EGFR突变的相关血清标志物中的应用

林勇蔡霖黄明翔陈新富叶建刚

1 福建省福州肺科医院胸外科 （福建 福州 350000）

2 福建省福州肺科医院病理科 （福建 福州 350000）

SELDI-TOF-MS蛋白指纹图谱技术在筛选肺腺癌EGFR突变的相关血清标志物中的应用

林勇1蔡霖2黄明翔1陈新富1叶建刚1

1 福建省福州肺科医院胸外科 （福建 福州 350000）

2 福建省福州肺科医院病理科 （福建 福州 350000）

目的：分析肺腺癌血清蛋白表达谱的改变，筛选并建立肺腺癌表皮生长因子受体（EFGR）突变组与未突变组的差异表达谱。方法：应用表面增强激光解析电离化飞行时间质谱（SELDI—TOF-Ms）技术，分析100例肺冰冻切片确诊腺癌患者的血清获得蛋白表达图谱，同时将术后标本行PCR及基因检测进行表皮生长因子受体（EFGR）检测获得EGFR突变情况。用Biomarker Pattem（BPs）软件分析肺腺癌EGFR突变组与未突变组差异蛋白并初步建立诊断模型。通过盲筛进一步验证诊断模型。结果：100例肺腺癌EGFR突变组54例，其中EGFR19外显子E746-A750缺失28例，EGFR21外显子L858R点突变26例，未突变46例，分析两组病例血清有7个显著差异的蛋白波峰（P＜0.05），其中蛋白质峰为M/Z 2890.91，4614.34、4887.88为3个提示肺腺癌存在EGFR突变的特异波峰。经BPs软件分析，并建立分类树模型。82例样本盲筛验证结果显示，其灵敏度为83.3%，特异度为88.2%。结论：SELDI—TOF-Ms技术可筛选出肺腺癌EGFR突变组蛋白并建立突变组与未突变组诊断的分类树模型，有望成为检测肺腺癌EGFR突变的辅助指标。

蛋白指纹图谱技术 精准医学 肺腺癌 表皮生长因子受体（EFGR）

近年，肺癌的精准靶向治疗已经成为晚期肺癌患者首选治疗方式，在所有肺癌突变位点中，肺腺癌的表皮生长因子受体（EGFR）基因突变在中国肺癌人群中最高，可高达50%左右，因此肺腺癌人群中有必要进行常规EGFR突变检测以指导下一步临床治疗，然后常规基因检测方法受组织标本局限性，检测费用高等影响[1]。表面加强激光解析电离化飞行时间质谱（Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Massspectrometry，SELDI—TOF-Ms）技术亦即蛋白指纹图谱技术是近几年发展起来的实验室诊断新技术[1,2]。本研究中，作者利用SELDI—TOF—MS技术分析肺腺癌EGFR突变患者血清蛋白表达谱的改变，以期获得可用于了解肺腺癌EGFR突变状态诊断和筛查的血清蛋白特异性生物标记物。

1.资料与方法

1.1 一般资料

收集本院外科2015年1月～2017年1月外科快速冰冻组织学确诊为腺癌的患者100例，术中采取其外周血标本送检；术后100例肺癌患者组织病理学均证实为肺腺癌，其中原位腺癌8例，微小浸润性腺癌12例，浸润性腺癌80例，男性39例，女性61例，平均年龄（61.56±8.74）岁，选择腺癌成分最多者蜡块进行肺癌EGFR基因检测。

1.2 EGFR PCR检测和基因测序

石蜡包埋的组织切片，PCR方法扩增EGFR基因外显子18、19和2l。引物序列分别为18forward：18reverse：tggagtttcccaaacactcag；19forward：attcgtggagcccaacag，19reverse：gccagtaattgcctgtttcc；21forward：gteageagcgggttacatct，21reverse：aagcagctctggctcacact。具体操作方法按照试剂盒（Takara）说明书进行。最后在ABI730测序仪上机测序。

1.3 蛋白指纹图谱技术检测

1.3.1 仪器和试剂。美国Ciphergen公司PBS-域-PLUS型表面增强激光解吸电离飞行时间质谱（SELDITOF-MS）；美国BIO-RAD公司CM10芯片；HPLC水（高纯水），尿素，乙晴（acetonit rile，ACN），三氟乙酸（trifuoro2acetic，TFA），芥子酸（sinapinicacid，SPA），32环乙胺212丙磺酸（CHAPS）等均购自美国Sigma公司。

1.3.2 血清蛋白质谱检测。取血清样本，冰上融解30min，10000r/min 4˚C离心2min。取96孔板，每孔分别加10滋l U9（9mol/L Urea，2%CHAPS，1%DTT）和5滋l血清，常温600r/min震荡30min。15min后，芯片用排枪加200滋l醋酸钠（100mmol/L，pH=4），在层析柜中600r/min，5min，轻拍，重复1次。U9处理后的96孔板放冰上，用排枪快速加入185滋l醋酸钠，6000r/min振荡2min。用排枪加100滋l处理好的样本到芯片上，600r/min振荡1h，甩掉，用力拍干。加入200滋l醋酸钠常温600r/min振荡5min甩干，重复3次。加入去离子水200滋l，连续2次。干后用50%饱和的SPA（SPA的溶剂为50%H2O垣50%乙腈垣0.5%TFA）1滋l，5min后再点1滋l，上机检测。

1.4 统计学处理

用Proteinchip Sohware 3.2.1软件采集血清蛋白质谱表达谱并做标准化处理，用BiomarkerWizard软件提取信噪比大于5的蛋白峰做后续统计分析变量，用SPSS 16.0软件对分组好的数据进行独立样本t检验分析，用BPS5.0软件对独立样本t检验分析结果P＜0.05的蛋白峰建立诊断决策模型并验证模型。

2.结果

2.1 EGFR基因突变情况

100例腺癌中发现EGFR突变病例54例，未突变46例，突变病例中EGFR19外显子E746-A750缺失28例，EGFR21外显子L858R点突变26例，未发现EGFR20突变。

2.2 肺癌患者血清标志性蛋白初步分析

BiomarkerWizard软件发现2000～20000Da优化检测到的蛋白总数为325个蛋白峰，其中P＜0.05的峰7个，见表1。

2.3 肺癌患者血清学诊断模型的建立

分析后自动挑选出以突变组与无突变组的诊断模型建立，由5个蛋白构建的，分别是M/Z 2890.91、4614.34、4887.88、5218.82、22339.9，当蛋白峰符合以下条件当M4887_88≤2.05433并且M4614_34≤2.83209并且M5218_82＞0.168603或M4887_88≤2.05433并且M4614 _34≤2.83209并且M22339_9≤0.0172995或M4887_88＞2.05433并且M2890_91≤0.236967则被模型判断为突变组，不符合的则为无突变组。诊断流程见表2。

表1. Independent Samples Test

表2. Diagnostic process

2.4 诊断模型的验证

用该模型双盲法分析了另外48例肺腺癌EGFR突变患者、34例肺腺癌无突变患者。82份血清标本中70例判断正确，12份判断错误。其中40例肺腺癌EGFR突变患者和30例肺腺癌EGFR无突变患者判断分正确，阳性检出率（敏感性）达83.3%，阴性检出率（特异性）达88.2%，见表3。

3.讨论

近年来，肺癌分子靶向精准治疗模式已经成为肺癌诊治领域的重大突破和研究热点，表皮细胞生长因子受体（EGFR）中19外显子E746-A750缺失和21外显子L858R点突变是最重要的肺癌突变序列，亚洲肺腺癌人群中突变率可高达40～50%，因此常规检查肺腺癌人群中的EGFR突变状态是诊治的关键。然而在某些情况下，肿瘤组织量不足、肿瘤细胞成分过少或肿瘤组织获取困难都会导致依赖组织的EGFR基因突变检测无法进行，因此有必要寻找可用于判别肺腺癌EGFR基因突变状态相关的的血清蛋白特异性生物标记物。

由基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）发展而来的蛋白质指纹图谱技术被广泛应用于筛选疾病诊断、疗效预测和预后相关标志物[3]。在肺癌应用方面，赵健[4]用于肺腺癌的早期筛查诊断，并筛选出m/z分子质量为8129.55，2022.18，3271.91，3933.44，3504.49，3811.71的6个血清肿瘤标志物，并以m/z为8 129.55为节点建立的诊断模型可区分肺腺癌患者与正常人，其敏感性为91.67%，特异性为80.00%，陈剑光[5]也采MALDI-TOF-MS技术运用于肺癌诊断模型的建立，筛选出分子量为11.66KD的标志蛋白为主根结点，联合3882.9、4673.2、3158.2和2047.2等四个标志蛋白建立了最佳的肺腺癌诊断模型，其特异性也高达，上述研究表明MALDI-TOF-MS技术在肺癌诊断领域具有很好的鉴别价值。

表3. rediction Success

然而MALDI-TOF-MS技术在预测肺癌分子靶向治疗有效性方面仅有少量报道，其中Taguchi等应用MALDITOF-MS检测139例吉非替尼或厄罗替尼治疗前NSCLC患者血清，建立一个具有8个特征性峰值的EGFR-TKI疗效计算模型，陈雪琴等采用该技术分析16例接受EGFR-TKI治疗的晚期NSCLC患者治疗前的血清蛋白水平，敏感组中筛选出7个差异蛋白质峰（P＜0.05），质荷比（M/Z）分别为2288、2678、4100、4606、4662、9602、11185Da， 杨琳等运用于352名EGFR基因突变状态明确的IIIB/IV期非小细胞肺癌患者中，发现EGFR基因突变和野生型患者之间有9个峰具有统计学差异（p0.05），m/z分别为1365.1、1866.47、3315.75、3883.79、3956.66、4092.4、4585.05、4643.49和5866.96。本组研究中，通过手术切除大体组织标本且采用测序方法检测客观反映了患者EGFR突变状态，并根据突变组与无突变组的诊断模型建立，筛选出7个P＜0.05特异波峰，M/Z分别为2239.57、2890.91、4614.34、4887.88、5218.82、5252.92、22339.9。其中蛋白峰中M/ Z 2890.91，4614.34、4887.88与陈雪琴组中2678、4100、4606、4662接近，4614.34、4887.88与杨琳组4585.05、4643.49接近，表明M/Z 2890.91，4614.34、4887.88代表同一个为有意义的可能反映患者存在EGFR突变的蛋白质峰，具有较高的特异性与重复性。另外本组研究中依据其中的5个特异波峰所建立的判断患者EGFR突变状态具有较高的特异性，可达89.3%，显示该技术具有较高的应用前景。同时我们也发现不同研究组中存在不同特异波峰，如研究组中5218.82、22339.9在其他研究组中未出现，这可能与各实验室的操作方法不同以及技术水平有关。蛋白质在体外极不稳定。受影响的冈素很多如温度、PH值、溶血等操作方法不当会严重影响实验结果。

血清是最容易获得和易于保存的人体样本，检查不会增加危险和痛苦，同时富含大量的生物学信息，结合MALDI-TOF-MS技术的特性所建立的反映肺腺癌EGFR突变状态诊断模型，可能是肺腺癌EGFR突变检测一个有效补充，本研究中蛋白质峰为M/Z 2890.91，4614.34、4887.88为3个提示肺腺癌存在EGFR突变的特异波峰，有必要进一步深入研究。然而由于样本量不够，能否应用于临床以及人群筛查还要经过大规模的临床验证，希望通过收集更多的肺腺患者标本，验证、优化和完善该模型。为日后真正应用于临床打下基础。

[1] 许洋.蛋白质指纹图谱技术在实验室诊断与临床医学中的研究进展[J].基础医学与临床,2007,27(2):134-142.

[2] Ward DC,Cheng Y,N,Kontchou G,et al.Changes in the serum proteome associated with the development of hepatocelluar carcinomal in hepatitis C-related cirrhosis[J].Br J Cancer,2006,94(2):287-292.

[3] 赵长宏,陆海波,马玉彦,等.血清蛋白质指纹图谱检测诊断早期胃癌临床意[J].肿瘤防治研究,2006,33(10):750-753.

[4] 赵健.应用SELDI-TOF-MS技术筛选肺腺癌患者血清诊断标志物[J].肿瘤基础与临床,2008,21(5):7-10.

[5] 陈剑光.利用SELDI-TOF-MS蛋白质指纹图谱技术建立肺腺癌诊断模型[J].实用医学杂志,2010,26(7):1093-1095.

Screening of EGFR Mutations in Lung Adenocarcinoma by Surface Enhancedlaser Desorptionionization Time of Flight Mass Spectrometry (SELDI—TOF-MS) Application of Related Serum Markers

LIN Yong1CAI Lin2HUANG Ming-xiang1CHEN Xin-fu1YE Jian-gang1
1 Department of Thoracic Surgery,Fuzhou Pulmonary Hospital (Fujian Fuzhou 350000)
2 Department of Pathology, Fuzhou Pulmonary Hospital (Fujian Fuzhou 350000)

1006-6586(2017)13-0011-03

R734.2

A

2017-06-02

蔡霖，通讯作者。

福州市科技计划项目（2014-S-138-3）。