黄曲霉及其毒素污染的防控技术研究新进展

李庄悦　李宇

摘要 如何削减黄曲霉及其毒素污染，是国内外学者非常关注和研究解决的重要课题。多年研究获得的物理、化学、生物等方法，已被用来解决黄曲霉及其毒素的污染问题，但至今未找到一种经济实用可大规模推广的解毒方法。因此，继续探寻和研发高效、廉价、无副作用的黄曲霉及其毒素污染防控措施，依然是当前科技工作者迫切需要解决的问题。本文主要从分子生物学、风险预警、拮抗微生物等方面介绍近年来黄曲霉及其毒素污染防控技术和方法的较新研究进展，并归纳出可能的研发趋势，以期为该领域今后进一步深入研究提供一些依据和参考。

关键词 黄曲霉；毒素污染；防控技术；研究新进展

中图分类号 Q949.32 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）14-0197-03

Abstract How to eliminate or decrease the infection of Aspergillus flavus and aflatoxin is an important subject which has been paid more attention by researchers. Measures of physics，chemistry and biology result from many years′ studys have been used to solve those problems，but have no practical and economical detoxifying method which could be generalized in large scale has been found.Accordingly，keeping exploring and researching some measures which can prevent and control Aspergillus flavus with high efficiency and no side effect is still impending to be solved for present researchers. This review article mainly introduced some new advances on preventing and controlling the infection of Aspergillus flavus and aflatoxin from molecule biology，risk prediction and antagonistic microbe，and concluded the possible research trends，so as to provide some references and evidences for going deep into researches on this field in the future.

Key words Aspergillus flavus；aflatoxin infection；preventing and controlling technology；new research progress

虽然传统的物理、化学和生物学方法已被用来解决食品、作物、饲料中黄曲霉毒素的污染问题，但都不能从本质上解决问题，至今还没有找到一种经济实用的可大规模推广的解毒方法。因此，亟需继续探寻和研发高效、价廉、无副作用的黄曲霉及其毒素污染防控措施。

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉、寄生曲霉、集蜂曲霉等产毒真菌在其生长后期产生的一类基本结构中以二氢呋喃环和香豆素为主的次级代谢产物[1]，是目前已知的化学物质中“三致”（致癌、致畸、致突变）性最强的一种，会使人体或动物的生长发育受阻、生长迟缓、免疫能力下降甚至死亡。目前，黄曲霉毒素中毒后还没有特效药物[2]。一般发霉的谷物、花生、种子、坚果以及发酵制品等中都会有黄曲霉的存在。已成功分离鉴定出约20种AFT衍生物，其中4种（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）为天然产生、毒性最强、在农作物中污染最严重[3]。

本文主要从分子生物学、风险预警、拮抗微生物等方面介绍近年来黄曲霉及其毒素污染防控技术和方法的较新研究进展，并总结归纳出可能的研发趋势和应用前景，以期为该领域今后进一步创新研究提供依据和参考。

1 黄曲霉及其毒素分子生物学防控技术研究新进展

近年来，分子生物学快速发展，黄曲霉的研究集中在生物防治、遗传育种、基因工程等方面。已从研究或实验室层面，培育出抗黄曲霉及其毒素的优良作物新品种，正在向应用方面探究和发展；通过产毒菌早期分子鉴定或关联性状基因表达，可以进行早期预警，达到中期或后期预防和控制的目的；而最新的尝试和探索是干预黄曲霉组蛋白甲基化，使其产毒基因沉默或敲除，从而阻止或抑制黄曲霉毒素的产生。

1.1 抗黄曲霉作物新品种的基因工程研究

近年来，在植物的抗病育种研究中进行分子标记技术的应用已取得一定成果，在杂交早期世代可以利用与抗病基因连锁的分子标记进行辅助选择，同时还可以排除其他因素如环境条件、花生种仁发育情况等对接种鉴定结果的干扰，提高育种效率。

雷 永等[4-5]采用AFLP技术和BSA分析方法，在国内外首次获得了与花生黄曲霉菌侵染抗性連锁的2个分子标记，并对抗、感黄曲霉的花生种质资源进行了分子鉴定，证明该标记可以用于研究群体之外的育种潜力。洪彦彬等[6]为了筛选出抗黄曲霉的花生品种，利用SSR标记方法，获得了5个与黄曲霉抗性相关的SSR标记，这些标记可能与花生的抗性基因连锁。田立荣[7]研究了花生抗黄曲霉遗传改良及育种的基因工程原理。

近年来，花生黄曲霉抗性改良育种的研究单位众多。广东省农业科学院选育的抗黄曲霉菌侵染的花生新品种粤油9号和粤油20，已分别通过国家农作物品种审定和广东省农作物品种审定[8]；福建农林大学油料所在1997年研究出抗黄曲霉的花生品种，并在2009年通过国家农作物品种审定委员会审定[9]。endprint

虽然基因工程技术育种研究已取得一些进展，但是仍处于初级阶段，尚未见有实际生产推广应用或商品化生产的例子。然而，抗黄曲霉品种的基因工程育种的确是黄曲霉防治的源头技术或实质性措施，开辟了黄曲霉及其毒素污染防控技术研究的新篇章，特别是随着基因工程技术本身的不断成熟，今后的研究前景和实践价值将非常广阔和令人期待。

1.2 黄曲霉毒素的分子预警技术研究

虽然黄曲霉分布广泛，但并不是所有的黄曲霉菌株都可以产生黄曲霉毒素。过去通常采用形态学、免疫学等传统检测方法等对真菌毒素进行检测，存在周期长、操作复杂、鉴别水平不够准确等缺点。随着分子生物学及其组学等学科的发展，现代分子生物学监测方法尤其是PCR技术在真菌毒素检测与鉴别方面得到了深入研究与发展，从而可以对刚刚产生的黄曲霉毒素的关键基因或关联因素进行及时或早期鉴定或监测，建立简便、快速、准确的产毒菌株分子鉴定或监测技术。

Somashekar等[10]选取黄曲霉毒素合成途径中的aflR和omt基因设计引物进行PCR扩增，结果表明，aflR引物只能从寄生曲霉和黄曲霉基因组中特异性地扩增出相应DNA片段，而omt引物还可从南海海洋真菌、R.oligosporous和鲁氏毛霉中扩增，但不能从棕曲霉、青霉菌和黑曲霉中扩增，从而可将寄生曲霉、黄曲霉与曲霉属的其他真菌以及青霉菌区分开。Schmidt研究表明[11]，关键基因aflR/aflS的表达量之比与温度×水分活度之间的交互作用相关，该比率越大AFB1含量越高，此方法可应用于对这2类真菌产毒的预警。

1.3 黄曲霉组蛋白甲基转移酶修饰效应研究

组蛋白甲基化是一种重要的组蛋白表观修饰，主要由一类含有SET结构域、被称为组蛋白甲基转移酶的蛋白质执行，可以有效调节染色质结构、基因组功能和基因表达等[12]。

因此，可以从组蛋白甲基化及其他表观遗传入手，制造对抗癌症等疾病的药物。精子发生过程中组蛋白甲基化错误也会直接影响表观遗传修饰的建立和维持，导致生精细胞异常甚至引发不育。由于组蛋白甲基化形式有上千万种，这就极大地增加了组蛋白修饰调节基因表达的复杂性，为组蛋白甲基化在精子发生过程中发挥调控作用提供了巨大的潜能[13]。

目前，关于植物组蛋白甲基转移酶的研究主要集中在拟南芥、水稻、玉米、烟草等模式植物中[14]。组蛋白甲基化转移酶是一类催化1～3个甲基基团转移到组蛋白赖氨酸或精氨酸上的酶，如G9a，又称常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶2。

笔者在福建农林大学相关学者的指导下，首次进行了干预产毒黄曲霉组蛋白甲基转移酶的创新研究（2015—2016年）。通过分子生物学手段，初步发现黄曲霉组蛋白甲基转移酶中的部分基因（如aflrmtA、bre2等基因）控制黄曲霉的产毒和生长，通过同源重组法敲除该基因后，黄曲霉产毒即可被抑制。试验表明，aflrmtA基因（精氨酸甲基转移酶基因）通过提高aflR、aflC和aflK基因表达，很大程度上调了在PDA和PDB培养的AFB1生物合成；进一步发现aflrmA是等离子体细胞膜损害、渗透性和过氧化氢诱导的氧化应激反应的重要调节物；也可抑制分生孢子生产和上调花生和谷物种子中AFB1的生物合成，还可提高蛋白酶和脂肪酶活性。总之，aflrmtA基因在真菌毒素生物合成的形态发生和黄曲霉致病性中起重要作用，而且可以成为能够控制黄曲霉污染作物的潜在靶基因。

2 黄曲霉毒素污染预警技术研究新进展

在作为收获前进行黄曲霉毒素污染预警，既省时省力，又能降低产后脱毒的投入，因而成为目前很多学者和科研单位的研究热点。花生产生黄曲霉毒素污染的主要原因是花生收获前28～42 d即结荚期遇到干旱和高温（22～35 ℃）天气[15]。基于CROPGRO-peanut模型，输入影响因子模拟花生荚果周围土壤和叶片的温度、植物缺水量等，再根据毒素含量与繁殖期气候参数（雨量、温度、日照等）的关系，进行花生黄曲霉毒素含量监控与预测[16]。

Whitaker等[17]对花生储藏、脱壳、漂洗过程中花生黄曲霉毒素的含量分布进行了研究。李瑞芳等[18]用Boltzmann和Logistic 2种模型模拟了储藏期间黄曲霉生长规律，当温度低于15 ℃、相对湿度低于85%时，可以预防黄曲霉毒素产生。Zhang等[19]研究获得100～190 ℃条件下花生中黄曲霉毒素动力学模型，成功应用于花生热加工过程中黄曲霉毒素的预警。

国内外以黄曲霉毒素生物合成前体代谢物作为AFB1的预警检测，进行了毒素前体代谢物预警方法初步研究。方明英[20]研究表明，黄曲霉和寄生曲霉在多种培养基中培养，杂色曲菌素（versicolorin A，VA）是其毒素生物合成过程中首个出现毒性作用基团——双呋喃环的化合物，可以在AFB1产生前检出。谭辉勇[21]探究表明，样品中VA和AFB1含量之间具有中度相关性，VA作为黄曲霉毒素的预警报告分子是可行的。

3 拮抗黄曲霉菌及其毒素的微生物研究新进展

有关微生物能够拮抗黄曲霉或者与黄曲霉竞争的研究，可归类为降解真菌毒素的生物学方法，但近年来又有较多新进展，特别是发现了多种拮抗细菌和不产毒黄曲霉和寄生曲霉控制黄曲霉毒素的污染，同时初步探明了降解毒素的可能机理。可以通过加入一种新的拮抗微生物，使微生物之间的分布发生改变，使产毒黄曲霉素的生长受到抑制，从而降低黄曲霉毒素的污染几率。拮抗菌种通过自身代谢产生某种胞内酶或者胞外酶，将黄曲霉毒素分子的毒性基团降解为无毒害的物质被生物利用或通过代谢排出体外；或者通过生物粘附作用，粘附黄曲霉毒素达到去除黄曲霉毒素的目的。

3.1 拮抗黄曲霉及其毒素的细菌研究概况

Shahin[22]從乳制品中分离出1株乳酸乳球菌和1株嗜热链球菌，分别吸附PBS（磷酸盐缓冲液）中54%和81%的AFB1，而热致死的这2种乳酸菌对AFB1的吸附能力分别达到了86%和100%。Gao等[23]从鱼内脏中发现一种枯草芽孢杆菌ANSB060，能够分别降低81.5%、80.7%和60.0%的AFB1、AFG1和AFM1；李俊霞[24]等首次发现能够降解AFB1的单胞菌属菌株嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomona ssp.），降解率达到85.7%。吉小凤等[25]筛选出发酵乳杆菌株LAB-10，对质量浓度为14 g/L的AFB1在48 h的降解率为63.4%，其脱毒机理为生物降解作用，同时该菌株属于安全性高的益生菌。endprint

我国研究者还获得了拮抗黄曲霉或降解AFT的多种芽孢杆菌。2011年涂彩虹等[26]从土壤中分离纯化出1株具有黄曲霉拮抗活性的枯草芽孢杆菌。2012年赵丽红等[27]等筛选出1株能够高效降解AFB1的枯草芽孢杆菌，商品化生产制剂为霉立解（MLJ），通過蛋鸡验证，霉立解可在一定程度上改善和缓解AFB1对蛋鸡的不利影响。2013年李松培等[28]得到1株能够降解AFB1的革兰氏阳性芽孢杆菌，降解率达到94%，且具有淀粉酶和蛋白酶分泌作用，这一特点有利于其作为产酶益生素进一步开发。

可见，在拮抗黄曲霉及其毒素的细菌研究方面，国内外研究者取得了可喜成果，既有处于发现和鉴别层面的初步研究，也有进入转化应用或商品化生产的难得技术成果。探寻和研发出了以芽孢杆菌为主的多种拮抗菌种，特别是具有益生素作用的降解黄曲霉毒素菌株，可以达到毒素降解和改善动物生理代谢的双重作用。总体上看，这方面研究潜力较大，且展现出广阔的应用前景。因此，仍需对其进一步挖掘和深入探寻。

3.2 拮抗黄曲霉及其毒素的真菌研究概况

Zanon等[29-31]从各国花生中分离得到的不产毒黄曲霉菌能有效减少花生中黄曲霉毒素污染。马忠华等[32]筛选出一株高效竞争菌AF051，可以抑制99%的黄曲霉菌生长。

目前，已发现许多真菌都能够将AFB1降解成低毒或无毒的产物[33-34]。此外，学者们还发现大型真菌能够降解AFB1。Motomura等[35-36]研究糙皮侧耳生成物时，得到能够降解AFB1的胞外酶，其分子量为90 kDa；并确定了该酶降解AFB1的最佳pH值、温度等信息。王会娟等[37]筛选出2株高产漆酶的平菇，且平菇中的漆酶含量与AFB1的降解具有一定的正向关系。

由上述得知，在拮抗黄曲霉及其毒素的真菌研究方面，国内外不仅探寻出多种不产毒黄曲霉菌高效拮抗或抑制黄曲霉毒素的菌种，而且发现许多真菌都能够将AFB1降解成低毒或无毒的产物。并通过大型真菌研究，初步揭示了其胞外酶降解黄曲霉毒素内酯环的可能生理机制。

4 结语

近年来，国内外对黄曲霉及其毒素污染防控技术和方法的研究，从分子生物学、风险预警、拮抗微生物等方面进行了较深入和多方面的研究，其主要结果或研发趋势归纳如下。

（1）黄曲霉及其毒素分子生物学防控技术研究发展迅速，已在基因工程技术育种、产毒菌早期分子鉴定预警、组蛋白甲基化干预尝试等方面，取得了一定研究成果和新进展。由于选育抗病品种周期长且在实际生产中很难成功种植转基因的植株，而且试验研究和大田生产存在很大差异，故目前来说还只是初级阶段。尽管分子生物学防控技术研究难度较大，但却是源头或实质性的防控举措。随着分子生物学技术本身的不断发展和日趋成熟，相信今后将有更好的研究前景和实用价值。

（2）通过对相关气象参数和土壤因子的经验数据规律总结和相关数学模型构建，可以计算出这些因素造成的黄曲霉毒素污染风险，并进行预警。已初步研究出花生收获前（结荚期）后（储藏、加工等）的预警模型和方法，并发现毒素生物合成前体代谢物杂色曲菌素，可作为AFB1的预警检测。该技术需要长期积累观测数据，然后运用研究构建的正确实用数学模型实现预警，对生产技术人员的专业水平要求高，同时预警后防控也需要一定的工作量。然而，在其他防控技术还不成熟或传统防控方法耗费更大的状况下，仍不失为一种行之有效的黄曲霉毒素污染防控措施[38-40]。

（3）在拮抗黄曲霉及其毒素的微生物研究方面，国内外研究者取得了较多的新进展。初步探寻出以芽孢杆菌为主的多种拮抗细菌种和不产毒曲霉菌高效拮抗真菌种，特别是开发出了既降解毒素又改善动物生理代谢、具有益生素作用的细菌株，并初步揭示了真菌降解毒素的生理机制。拮抗微生物防控技术研究，目前大多处在发现和鉴别层面，也有少数技术成果已进入应用推广阶段。虽然从拮抗菌种研究、筛选到产品定型、推广应用需要较长时间和不懈的完善，但这方面防控技术措施具有天然、绿色、生态的可持续性和良好应用前景，从而代表了黄曲霉毒素污染防控技术研究的主要方向之一。

5 致谢

衷心感谢福建农林大学生命学院汪世华教授对本文的指导和提出宝贵意见！

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