2种罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷含量比较研究

冯春艳，卿德刚，倪慧，孙宇，张娟，贾晓光，徐建国

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002)

2种罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷含量比较研究

冯春艳1，卿德刚2，倪慧2，孙宇2，张娟2，贾晓光2，徐建国2

(1.新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，乌鲁木齐 830002)

【目的】建立并测定罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷含量的HPLC方法，并比较2种罗布麻叶中3种黄酮成分的含量差异。为2种罗布麻质量控制提供方法和依据。【方法】采用Symmetry Shield(250 mm× 4.6 mm，5 μm)色谱柱，在35℃条件下以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为360 nm，进样量为10 μL。【结果】芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的线性范围分别为0.251 1～1.255 4 μg、0.026 6～0.265 9 μg、0.235 6～1.178 0 μg，相关系数R分别为0.999 8、0.999 9、0.999 9；平均加标回收率分别为103.6%、102.1%、104.4%，RSD均小于3.8%。大叶白麻中异槲皮苷含量最高，罗布红麻中芦丁含量最高，并且仅有罗布红麻中检测到了金丝桃苷。【结论】HPLC测定方法可用于罗布麻叶中3种黄酮成分的含量测定，2种罗布麻叶中3种黄酮成分含量差异有一定规律，罗布红麻中异槲皮苷含量略高于大叶白麻，芦丁含量则至少是大叶白麻的13倍，金丝桃苷含量仅为0.05%，且在大叶白麻中未检测到金丝桃苷，研究结果可为2种罗布麻质量控制提供方法和依据。

罗布麻；芦丁；金丝桃苷；异槲皮苷；HPLC

0 引 言

【研究意义】罗布麻是药食同源植物，在中国和日本均被用作茶饮。《本草纲目》记载，罗布麻有平心悸、止眩晕、消咳止咳、强心利尿之功能。现代药理学研究表明，罗布麻对预防和治疗高血压、高血脂有较好疗效。中国药典[1]收载罗布麻(ApocynumvenetumL.)为罗布红麻，由于罗布麻产量较少，我国市场尤其是新疆市场上广泛存在大叶白麻(P.henderconii(Hook.f.))作为罗布红麻代用品[2-4]。明确罗布红麻和大叶白麻的化学成分异同，对二者的应用及质量控制都有积极意义。【前人研究进展】目前，罗布麻的质量控制主要围绕其中的黄酮类成分进行，包括槲皮素、金丝桃苷、白麻苷、异槲皮苷、山奈酚等。2005年版中国药典罗布麻叶项下收载了槲皮素的含量测定[5]，2010年版、2015版中国药典罗布麻叶项下则要求金丝桃苷含量不得低于0.30%[1、6]。另外有文献报道，不同采收期、不同种属和产地的罗布麻叶中黄酮类含量各有差异[3]。在研究中发现，芦丁、异槲皮苷在罗布红麻和大叶白麻中含量都较高，但仅有罗布红麻中可检测到金丝桃苷，同时2种罗布麻中都未检测到槲皮素。【本研究切入点】大叶白麻常作为罗布红麻的代用品，但二者的功效成分差异并不明确，研究选择罗布麻叶中的主要功效成分建立含量测定方法并进行定量比较。【拟解决的关键问题】建立同时测定罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷含量的HPLC方法，并比较2种罗布麻中3种黄酮成分的含量差异。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 仪器

Thermo U3000高效液相色谱仪，AB265-S电子天平(梅特勒-托利多公司)，水浴锅(金坛市华峰仪器有限公司)，JY92-2D超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2 试剂与材料

乙腈为色谱纯，磷酸、乙醇等为分析纯。芦丁(含量为91.9%，100080-201610，中国药品生物制品检定所)、金丝桃苷(含量为94.3%，111521-201507，中国食品药品检定研究院)、异槲皮苷(含量为92.9%，111809-201403，中国食品药品检定研究院)。罗布麻(阿勒泰戈宝茶股份有限公司，ApocynumvenetumL.)，大叶白麻(百草堂大药房、新特药大药房、济康大药房、普济堂大药房，P.henderconii(Hook.f.))。

1.2 方 法

1.2.1 HPLC含量测定

1.2.1.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry Shield(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；检测器：VWD-3000； 流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱(0～10 min，15%：85%；10～50 min，18%：82%)；流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：35℃，进样量10 μL。

1.2.1.2 对照品溶液制备

精密称取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷适量，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，分别制成浓度为 0.125 5、0.026 6、0.117 8 mg/mL的对照品溶液，即得。

1.2.1.3 供试品溶液制备

参照药典方法，精密称取罗布麻叶粉末(过三号筛)0.5 g，置于圆底烧瓶中，加 50%甲醇 50 mL，称重，80℃水浴加热回流提取 0.5 h，提取液放冷，再次称重，用50%甲醇补足减失重量，过滤，即得[1]。进样前需经0.22 μm的微孔滤膜过滤。

1.2.1.4 线性关系

分别精密吸取10、8、6、4、2、1 mL的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品溶液于10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制得对照品溶液。每次取10 μL，依次进样。 按“1.2.1.1”项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.1.5 方法学验证

分别进行精密度实验、稳定性试验、重复性试验、加回收率试验，对建立的HPLC含量方法进行评价。

2 结果与分析

2.1 线性关系

芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷分别在0.125 6～1.255 4、 0.026 6～0.265 9和0.117 8～1.178 0 μg/L的范围内呈良好的线性关系，回归方程。表1

表1 3种成分线性关系

2.2 精密度

精密称取罗布麻叶适量，制备供试品溶液，按“1.2.1.1”项下色谱条件连续进样6次。结果，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.28%、1.24%、0.16%，表明仪器在该色谱条件下精密度良好。 表2

2.3 稳定性

精密称取罗布麻叶适量，制备供试品溶液，室温放置0、4、8、24 h后分别按“1.2.1.1”项下色谱条件测定。结果芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.23%、1.08%、0.51%，表明供试品溶液在24 h内稳定。表3

2.4 重复性

精密称取同批罗布麻叶6份，制备供试品溶液，分别按“1.2.1.1”项色谱条件测定。结果表明，罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷平均含量分别为0.65%、0.05%、0.46%,RSD分别为1.63%、3.15%、2.83%，表明该方法重复性良好。表4

表2 精密度

表3 稳定性

表4 重复性

2.5 加标回收率实验

精密称取罗布麻叶18份，6份为一组，分别制备供试品溶液，并精密加入不同体积的芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品溶液，称重、补足减失重量，按“1.2.1.1”项色谱条件测定。研究表明，芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的平均加标回收率分别为103.6%、102.1%、104.4，RSD值分别为2.4%、3.1%、3.8%，该方法准确度较高。表5

2.6 样品测定

分别测定9批罗布麻叶中3种黄酮成分的含量，对照品和供试品色谱图。结果表明，6批大叶白麻中芦丁含量最大相差2.5倍，最低、最高含量分别为0.02%、0.05%，并且均未检测到金丝桃苷，异槲皮苷含量基本一致，在0.32%～0.38%；3批罗布红麻中芦丁含量分别为0.65%、0.66%、0.63%，且至少是大叶白麻的13倍，虽都检测到了金丝桃苷，但含量仅为0.05%，远未达药典0.30%的要求，异槲皮苷平均含量为0.45%，略高于大叶白麻。表6，图1，图2

表5 加标回收率实验结果(n=6)

1.芦丁 2.金丝桃苷 3.异槲皮苷

1. rutin 2. hyperoside 3.isoquercitrin

图1 对照品HPLC色谱

Fig.1 HPLC chromatogram of reference substance

1.芦丁 2.金丝桃苷 3.异槲皮苷

1. rutin 2. hyperoside 3.isoquercitrin

图2 供试品HPLC色谱

3 讨 论

3.1 色谱条件

为了提高色谱峰分离度并使出峰时间合理，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱的方法。由于金丝桃苷和异槲皮苷的色谱峰不易分开，曾尝试调整乙腈比例，但二者始终不能完全分离。温度对二者的分离有明显改善作用，当温度为35℃时两个色谱峰分离良好，分离度达4.14。综合考虑，选择在35℃的条件下进行梯度洗脱。

3.2 罗布麻叶中黄酮类成分差异

对罗布红麻和大叶白麻中芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷3种黄酮成分进行了比较。结果表明，罗布红麻中异槲皮苷含量略高于大叶白麻，芦丁含量则至少是大叶白麻的13倍，并且罗布红麻中金丝桃苷含量远未达到药典0.30%的要求，而6批大叶白麻中都未检测到金丝桃苷。石秋梅等的研究表明[2-4]，罗布红麻中3种成分含量由高到低依次为芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷，大叶白麻中3种成分含量由高到低依次为异槲皮苷、芦丁、金丝桃苷，蔡卿龄等的研究也表明[7-8]大叶白麻中金丝桃苷含量很少甚至检测不到，这些结果与该研究结果基本一致。但是，张语迟等[9]研究认为，芦丁是大叶白麻的特征性成分，可以用于区分2种罗布麻。然而，研究表明罗布红麻中的芦丁含量高达0.65%，并且远远高于大叶白麻，所以如何从化学成分的角度区分罗布红麻与大叶白麻还需要更深入的研究。

Haijuan An等[10]对罗布红麻和大叶白麻的黄酮成分进行了研究，结果检测的29批罗布红麻中仅有4批金丝桃苷含量符合药典0.30%的规定，定量分析结果表明金丝桃苷并不是罗布麻中含量最高的黄酮成分，这与研究结果一致。该研究结果还表明，罗布红麻中主要黄酮成分为槲皮素-3-O -(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、异槲皮苷、金丝桃苷，并且罗布红麻中金丝桃苷、黄芪甙、槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、槲皮素-3-O-(6''-O-乙酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)葡萄糖苷含量明显高于大叶白麻，而大叶白麻中的黄酮成分主要是槲皮素-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷、异槲皮苷，并且未检出三叶豆苷、槲皮素-3-O-(6''-O-乙酰)半乳糖苷、山奈酚-3-O-(6''-O-丙二酰)半乳糖苷。因此，探寻综合评价手段来控制罗布麻质量更有利于其安全、有效的应用。

4 结 论

大叶白麻在新疆及毗邻地区有较多种植，在新疆市场更是作为罗布红麻的代用品长期存在。因此，明确2种罗布麻的化学成分、药理活性差异，对二者安全、有效的应用具有积极意义。实验结果表明，HPLC测定方法可用于罗布麻叶中3种黄酮成分的含量测定，2种罗布麻叶中3种黄酮成分含量差异有一定规律，罗布红麻中异槲皮苷含量略高于大叶白麻，芦丁含量则至少是大叶白麻的13倍，金丝桃苷含量仅为0.05%，且在大叶白麻中未检测到金丝桃苷，此研究结果可为2种罗布麻质量控制提供方法和依据。

References)

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2015年版-部) [M].北京：化学工业出版社,2015：211.

National Pharmacopoeia Commission. (2015).PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(2015 Ed.) [M]. Beijing: Chemical Industry Press: 211. (in Chinese)

[2]强静, 李奇, 刘训红, 等. 大花罗布麻叶黄酮类成分的分析[J]. 新疆中医药, 2009, 27(5): 31-34.

QING Jing, LI Qi, LIU Xun-hong, et al. (2009). Analysis of Flavonoids in Apocynum venetum L. [J] .ChineseJournalofTraditionalChineseMedicine, 27(5): 31-34. (in Chinese)

[3]石秋梅, 邓翻云, 吴敏言. HPLC法同时测定新疆产2 种罗布麻叶中芦丁、金丝桃苷及异槲皮苷含量[J]. 中草药, 2014, 45(9): 1 326-1 329.

SHI Qiu-mei, DENG Fan-yun, WU Min-yan.(2014).Determination of rutin, hyperoside and isoquercitrin in two kinds of Apocynum venetum L. in Xinjiang [J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs, 45 (9): 1,326-1,329. (in Chinese)

[4]邓翻云，吴敏言，尹传华，等．罗布麻和大叶白麻黄酮类成分的比较研究[J]．食品研究与开发,2012，33(7)：23-25.

DENG Fen-yun, WU Min-yan, YIN Chuan-hua, et al. (2012). Comparative study on the contents of flavonoids in Apocynum venetum and Larix gmelinii [J].FoodResearchandDevelopment, 33(7): 23-25. (in Chinese)

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2005年版-部) [M].北京：化学工业出版社,2005：147.

National Pharmacopoeia Commission. (2005).PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(2005 Ed.) [M]. Beijing: Chemical Industry Press: 147. (in Chinese)

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版-部) [M].北京：化学工业出版社,2010：196.

National Pharmacopoeia Commission. (2010).PharmacopoeiaofthePeople'sRepublicofChina(2010 Ed.) [M]. Beijing: Chemical Industry Press: 196. (in Chinese)

[7]蔡卿龄，张勇，魏原杰，等. 新疆产大叶白麻不同部位黄酮类成分含量分析[J].食品科学,2014，35(4)：211-214.

CAI Qing-ling, ZHANG Yong, WEI Yuan-jie, et al.(2014). Preparation of Flavonoids in Different Parts of Leaves of Pleurotus ostreatus in Xinjiang [J].FoodScience, 35 (4): 211-214. (in Chinese)

[8]石雪萍, 吴亮亮. 高效液相色谱测定不同采收期罗布麻中黄酮含量[J].食品与生物技术 学报, 2013, 32(10): 1 115-1 119.

SHI Xue-ping, WU Liang-liang.( 2013). Determination of Flavonoids in Apocynum venetum L. by High Performance Liquid Chromatography [J].JournalofFoodScienceandBiotechnology, 32 (10): 1,115-1,119. (in Chinese)

[9]张语迟，刘春明，刘志强，等. 罗布白麻与罗布红麻的液相色谱-质谱联用分析[J].分析测试学报，2009,28(10)：1 148-1 154.

ZHANG Yu-chi, LIU Chun-ming, LIU Zhi-qiang, et al. (2009). Analysis of rap white linen and rover kenaf by liquid chromatography - mass spectrometry [J].ChineseJournalofAnalyticalChemistry, 28 (10): 1,148-1,154. (in Chinese)

[10] An, H., Wang, H., Lan, Y., Hashi, Y., & Chen, S. (2013). Simultaneous qualitative and quantitative analysis of phenolic acids and flavonoids for the quality control of apocynum venetum l. leaves by hplc-dad-esi-it-tof-ms and hplc-dad.JournalofPharmaceutical&BiomedicalAnalysis,85(11): 295-304.

Comparative Study on the Contents of Rutin, Hyperoside and Isoquercitrin in Two Kinds of Apocynum Leaves

FENG Chun-yan1, QING De-gang2, NI Hui2, SUN Yu2, ZHANG Juan2, JIA Xiao-guang2, XU Jian-guo2

(1.College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046， China;2. Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnodrug, Urumqi 830002, China)

【Objective】 To determine the content of rutin, hyperoside and isoquercitrin in apocynum leaf by HPLC, and compare the content of 3 flavonoids in Apocynum leaf from different sources.【Method】The assay was performed on symmetry column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), eluted with a gradient of acetonitrile-0.2% aqueous phosphoric acid at 35℃. The rate of flow was 1.0 mL/min, detection wavelength was 360 nm, the infection volume was 10 μL. 【Result】The linear ranges of rutin, hyperoside and isoquercitrin were 0.251,1-1.255,4 μg, 0.026,6-0.265,9 μg, and 0.235,6-1.178,0 μg, and the correlation coefficients were 0.999,8, 0.999,9 and 0.999,9 respectively; The average recovery rates were 103.6%, 102.1% and 104.4%, respectively and the RSD was less than 3.8%. The content of isoquercitrin inPoacynumhendersonii(Hook. f.) Woodson was the highest，rutin inApocynumvenetumLinn was the highest ,and hypericides were detected only inApocynumvenetumLinn. 【Conclusion】HPLC method can be used to determine the content of 3 flavonoids inApocynumvenetumL. There are certain rules in the content of 3 flavonoids in two kinds ofApocynumvenetum, and the results can provide two methods and basis for quality control ofApocynumvenetum, The content of isoquercitrin in Apocynum venetum Linn is slightly higher than that of Poacynum hendersonii (Hook.f.) Woodson, the content of hyperoside is only 0.05%, no hypericides were detected in Poacynum hendersonii (Hook.f.) Woodson, and the results can provide two methods and basis for quality control of Apocynm venetum.

apocynum leaf；rutin；hyperoside；isoquercitrin；HPLC

Zhang Juan (1983-), female, Xinjiang, associate professor, master, research direction for Natural Product Research and Development. (E-mail) 372627151@qq.com

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.07.015

2017-05-10

新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项资金“中小企业健康产品研发与推广”(2016D04004)，第二师科技计划项目“吗咖、肉苁蓉等相关保健食品的开发”

冯春艳(1987-)，女，河南人，硕士生，研究方向为食品科学专业，(E-mail)13807395@qq.com

张娟(1983-)，女，新疆人，副研究员，研究方向为天然产物研究与开发，(E-mail)372627151@qq.com

S567

A

1001-4330(2017)07-1291-07

Supported by: Xinjiang Uygur Autonomous Region scientific research institution and development of special funds " Development and Promotion of Health Prducts for Small and Medium-sized Enterprises (2016D04004) ； the second division of science and technology projects " Ma coffee, Cistanche and other related health food development