2，4—二叔丁基苯酚为内标高效液相色谱法测定丙泊酚血药浓度

万海方+黄焱明+汪国香+罗宏+张相彩+陶凡+赵萃+王振

[摘要] 目的 建立以2，4-二叔丁基苯酚为内标的高效液相色谱法测定丙泊酚血药浓度方法。 方法 血清样品用乙腈-甲醇（75：25）混合液蛋白沉淀后取上清液进样分析，以2，4-二叔丁基苯酚为内标，采用UltimateRXB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水（H3PO4调pH=1.8）-乙腈（70∶30）为流动相，流速1.5 mL/min，检测激发波长270 nm。结果 该法专属性高，回收率高，日内日间RSD低。丙泊酚血药浓度在0.2～10.0 mg/L范围内线性关系良好（r2=0.9998），最低检测浓度0.2970 mg/L。 结论 本方法测定丙泊酚浓度方便、快捷、准确度好、精密度高，为开展血药浓度检测、药动学研究提供方法学依据。

[关键词] 丙泊酚；高效液相色谱法；血药浓度；2，4-二叔丁基苯酚

[中图分类号] R614 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2017）20-0105-04

[Abstract] Objective To establish a detecting method of propofol plasma concentration by HPLC with 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard. Methods The supernatant of serum samples were analyzed after protein precipitation by acetonitrile-methyl alcohol（75∶25） mixed liquor. With 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard， UltimateR XB-C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Water（H3PO4， pH=1.8）-acetonitrile（70∶30） was used as mobile phase， flow velocity=1.5 mL/min， and detecting excitation wave length=270 nm. Results This method had high specificity and recovery， with low intra-day and inter-day RSD. When the plasma concentration of propofol was between 0.2～10.0 mg/L， it showed a good linear relation（r2=0.9998）， and the lower limit of detection was 0.2970 mg/L. Conclusion This method is convenient and speedy， with high accuracy and precision， providing a methodological basis for plasma concentration detection and pharmacokinetic research.

[Key words] Propofol； HPLC； Plasma concentration； 2， 4-ditert-butyl phenol

丙泊酚（propofol），2，6-二异丙基苯酚，又名异丙酚，是速效短效静脉麻醉药。近年来，国内外有关丙泊酚药物代谢动力学的研究较多[1-4]，但未见丙泊酚应用于结核性脓胸患者的药动学研究。为开展该研究，为临床麻醉合理使用丙泊酚提供依据，本文建立了以2，4-二叔丁基苯酚为内标的高效液相色谱法测定丙泊酚血药浓度。现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国，Agilent），配有G1311A四元泵、G1315D紫外检测器、G1329A型进样器（配有20 μL 进样环）、G1316A柱温箱和Agilent化学工作站；XS205 Dual Range分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；Mettler Toledo Delta 320 pH计（瑞士，Mettler Toledo）；高速离心机（美国，Thermo Fisher）；Barnstead TII超纯水系统（美国，Thermo Fisher）；-80℃冰箱（日本，SANYO）。

1.2 药品与试剂

丙泊酚注射液（规格：200 mg/支，批号：AJ059）、丙泊酚对照品（日本东京化成工业株式会社生产，规格：25 g，批号：ZR28L-FK，纯度>98.0%）；内标：2，4-二叔丁基苯酚（北京百灵威科技有限公司生产，规格：100 g，批号：LI200111，纯度≥99.5%）；色谱级乙腈和甲醇从美国天地公司购得，本文中其他所有分析级化学品均由天津永大化学试剂有限公司购得；实验用超纯水均由美国赛默飞世尔Barnstead TII 超纯水系统纯化制得。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：UltimateRXB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭材料科技有限公司），流动相：水（H3PO4调pH=1.8）-乙腈（70∶30）；检测波长：270 nm；柱温：30℃；流速：1.5 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 稀释液 乙腈-甲醇（75：25）。

2.2.2 丙泊酚對照品溶液 精密称取40.00 mg丙泊酚对照品至10 mL容量瓶中，用稀释液溶解，定容至刻度；精密移取上述溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀，待用。

2.2.3 2，4-二叔丁基苯酚儲备液 精密称取10.00 mg 2，4-二叔丁基苯酚对照品至10 mL容量瓶中，用稀释液溶解，定容至刻度。

2.2.4 2，4-二叔丁基苯酚对照品溶液 精密移取2，4-二叔丁基苯酚储备液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀，待用。

2.3 血样处理

取出存放在-80 ℃冰箱中血样，室温解冻后取血样400 μL，加入10 μL 内标2，4-二叔丁基苯酚储备液，590 μL 稀释液，涡旋5 min，2000 g离心15 min，取上层清液进样。

2.4 方法专属性实验

取空白血样400 μL，加入600 μL 稀释液，涡旋5 min，2000 g离心15 min，取上层清液进样，得空白血清色谱图1A，将一定浓度的丙泊酚标准品及内标加入空白血清，按2.3项操作得色谱图1B，受试者注射丙泊酚后，同法操作，得色谱图1C，可见丙泊酚与内标2，4-二叔丁基苯酚的保留时间分别为6.65 min和10.67 min，两者峰形良好，分离完全，理论塔板数按丙泊酚计算不低于14 837。

3 结果

3.1 标准曲线

取丙泊酚对照品，配制成浓度分别为0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。以丙泊酚的浓度（X）为横坐标，丙泊酚的峰面积（Y）为纵坐标，得到标准曲线回归方程为：Y=3.2733X-0.1223（r2=0.9998）。定量下限为0.2 mg/L。见图2。

3.2 回收率试验

取空白血清加入丙泊酚对照品，制备成浓度分别为0.5、1.0、10.0 mg/L 的质量控制血清样品，各5份，按照2.3项下方法操作，进样测定，计算回收率，结果见表1。

3.3 精密度试验

取空白血清，加入丙泊酚对照品，制备成浓度分别为0.5、1.0、10.0 mg/L 的质量控制血清样品，各5份，按照2.3项下方法操作，1 d内重复测定5次，以测定日内RSD。另取上述不同浓度的血清样品，同样处理，每日测定1次，重复测定5 d，以测定日间RSD，结果见表1。

3.4 临床样品准备

胸外科结核性脓胸住院手术患者10例，年龄27～63岁，体重47～63.5 kg，1%丙泊酚按2 mg/kg的剂量单次静脉给予，20 s注射完毕，分别于给药结束后2、4、6、8、10、15、20、30、60、90 min通过桡动脉测压管采动脉血1.5 mL，分离血清，存放在-80℃冰箱中，测定丙泊酚血药浓度。结果见图3。

4讨论

结核病严重影响人民健康，是我国重点防治疾病之一[5]。对结核性脓胸及时、准确的诊断和有效的治疗，不仅有利于患者健康，而且对消除传染源、控制结核病流行起重要的作用。近年来结核性脓胸的发病有所增加，并且出现了耐药菌，通过外科手术治疗方法对患者的病灶给予清除，以达到缩短疗程、治愈的目的[6-9]。丙泊酚是临床上常用的麻醉药[10，11]，其起效快，作用时间短，且麻醉后舒适感较好，是胸外科结核性脓胸患者静脉麻醉首选药物，还广泛用于无痛肠镜、无痛胃镜检查以及无痛人工流产术和重症监护室镇静等。近年来，丙泊酚浓度测定及药物代谢动力学研究较多，测定丙泊酚血药浓度对指导临床合理用药具有重要的意义。丙泊酚血药浓度的测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）[12]、气-质联用（GC/MS）[13]、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[14]。后两种方法的灵敏度较高、特异性强、所需样品量少，但仪器设备较昂贵，难以普及推广。在高效液相色谱法中，电化学和二极管阵列检测法国内应用较少。目前文献报道的高效液相色谱法主要有高效液相-紫外检测法（HPLC UV）、高效液相-荧光检测法（HPLC Flu）。为适应临床药代动力学研究的需要，本实验室经过色谱条件、内标确立和流动相的选择、方法专属性实验等研究建立测定人血浆中丙泊酚浓度的方法，以2，4-二叔丁基苯酚为内标高效液相色谱法测定丙泊酚浓度。

本实验以2，4-二叔丁基苯酚为内标高效液相色谱法测定丙泊酚血浆药物浓度，该方法简单、易行、可重复。虽然质谱法检测丙泊酚血药浓度在很多研究中使用，但由于质谱设备昂贵，很多实验室还没有该设备[15，16]。研究报告显示高效液相色谱法甚至可以与质谱法达到相近的定量下限[17]。

本实验样品预处理方法选择乙腈-甲醇（75∶25）混合液蛋白沉淀法，较萃取法简单，并且不需要大量的有机溶剂如环己烷、氯仿-乙酸乙酯混合液[18，19]，也不需要花费昂贵的试剂盒[14]。流动相选用水（H3PO4 调pH=1.8）-乙腈（70∶30）时，丙泊酚和2，4-二叔丁基苯酚内标出峰时间合理，色谱峰形理想，而当采用三氟乙酸调节水pH值时，虽然出峰时间合理，但色谱图中基线不稳定。血中代谢物质和其他内源性物质的峰均不干扰丙泊酚的测定，说明该方法具有较高的专属性。

本方法测定丙泊酚浓度方便快捷，一天可以检测完10例患者的100个血样，临床样品测定结果表明，丙泊酚2 mg/kg 静脉注射后2、4、6、8、10、15 min的平均血药浓度与吴健等[20]报道的接近。该法检测到最低浓度为0.2970 mg/L，灵敏度高，可满足临床药动学研究需要，为开展血药浓度检测、药代学研究提供方法学依据。

总之，以2，4-二叔丁基苯酚为内标高效液相色谱法测定丙泊酚在结核性脓胸患者血浆药物浓度可行、方便，准确，能够为临床合理使用该药物提供依据。

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（收稿日期：2017-05-03）