球后Tenon囊下注射Bevacizumab对豚鼠脉络膜新生血管的抑制作用研究

胡启迪+朱冬青+易全勇+陈安颖+吴国海+邬一楠

[摘要] 目的 比较Bevacizumab（贝伐单抗）球后Tenon囊下注射和玻璃体腔注射对氪激光诱导的豚鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生成及發育的影响。 方法 随机数字表法将30只豚鼠右眼建立CNV模型后分为激光组、Tenon囊下组、玻璃体腔组，每组各10只。激光组仅进行光凝处理，Tenon囊下组和玻璃体腔组光凝后分别予以球后Tenon囊下和玻璃体腔注射Bevacizumab，21 d后全部行右眼吲哚菁绿血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）、眼底彩照及HE染色观察。 结果 ICGA检查，各组激光斑CNV发生率分别为激光组（65.0%）、Tenon囊下组（58.0%）、玻璃体腔组（55.0%）；Tenon囊下组和玻璃体腔组CNV渗漏面积均比激光组减少（P<0.01），且两组之间差异无统计学意义（P>0.05）；HE染色CNV最大中央厚度与ICGA检查趋势一致。 结论 Bevacizumab能够抑制氪激光诱导的豚鼠CNV的发育，Bevacizumab球后Tenon囊下注射和玻璃体腔注射疗效相近，为CNV的治疗提供了新思路。

[关键词] 贝伐单抗；玻璃体腔；Tenon囊；脉络膜新生血管；豚鼠

[中图分类号] R778.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）20-0036-04

[Abstract] Objective To compare the effects of retrobulbar Tenon subcapsular injection of bevacizumab and vitreous cavity injection on the formation and development of choroidal neovascularization（CNV） induced by krypton laser in guinea pigs. Methods CNV model was established in 30 right eyes of guinea pigs. The pigs were divided into three groups according to the random number table： laser group， Tenon subcapsular group and vitreous cavity group， with 10 pigs in each group. The laser group was only given photocoagulation. The Tenon subcapsular group and vitreous cavity group were given retrobulbar Tenon subcapsular injection and vitreous cavity injection of bevacizumab respectively after photocoagulation. After 21 days， indocyanine green angiography （ICGA）， fundus color photograph and HE staining were performed in all right eyes. Results ICGA examination showed that the number of laser spots showing fluorescence in each group（CNV incidence rate） were laser group（65.0%）， Tenon subcapsular group（58.0%）， vitreous cavity group （55.0%）； CNV leakage areas in the Tenon subcapsular group and vitreous cavity group were both less than the laser group（P<0.01）， and there was no statistically significant difference between the two groups（P>0.05）； CNV maximum central thickness by HE staining is consistent with the trend of ICGA examination. Conclusion Bevacizumab is able to inhibit the development of CNV induced by krypton laser in guinea pigs. Retrobulbar Tenon subcapsular injection and vitreous cavity injection of bevacizumab have a similar efficacy， providing a new thought for the treatment of CNV.

[Key words] Bevacizumab； Vitreous cavity； Tenon capsule； Choroidal neovascularization （CNV）； Guinea pigs

脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是导致渗出型年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）、病理性近视、中心性渗出性脉络膜视网膜炎、血管样条纹症、组织胞浆菌病综合征等多种疾病视力严重下降的重要原因。目前国内外学者对CNV发生、发展机制及其防治方法进行了大量深入的研究探索。Bevacizumab（贝伐单抗）是全长的人源化的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体，目前已有临床研究显示玻璃体腔内注射Bevacizumab能促使多种原因[1-5]导致的CNV及特发性CNV[5，6]消退，黄斑水肿吸收[7，8]。但此种给药方式可能会产生很多并发症，如眼内感染、眼内出血、白内障形成、视网膜脱离等[9]，危害严重，且该药需反复注射，风险极高。球后Tenon囊下注射主要依靠药物对后极部巩膜的穿透而治疗眼底病，几乎无任何风险，可以频繁注射。因此，本研究建立氪激光诱导的豚鼠CNV模型，通过比较玻璃体腔注射VEGF抑制剂Bevacizumab和球后Tenon囊下注射Bevacizumab的疗效，以期发现疗效好且并发症少的治疗方法，为CNV的治疗提供新线索和新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物

英国属三色豚鼠30只，雌雄各半，年龄约3周龄，体质量（150±10）g，购于北京维通利华动物实验有限公司，生产许可证号SCXK（京）2014-2015。宁波大学实验动物中心清洁级动物房饲养，自由进食饮水。所有动物的使用均遵照国家科学技术委员会于1988年颁布的《实验动物管理条例》，并通过宁波市眼科医院动物使用伦理委员会审核。

1.2 主要试剂和仪器设备

Bevacizumab（上海武昊经贸有限公司），注射用吲哚菁绿（丹东医创药业有限责任公司），海德堡眼底血管造影仪（HRA-2），多波长氪激光系统（Novus Omni； Lumenis Inc.），光学显微镜（Olympus BX51）。

1.3 模型建立方法

实验前乙醚吸入麻醉动物，右眼复方托吡卡胺眼液充分散瞳，90 D前置镜观察眼底，用波长532 nm的氪激光在靠近视盘上方处进行光凝，光斑直径50 μm，曝光时间100 ms，激光输出功率140 mW，共10个点，分成2排，每排5个点，以光凝时气泡感为Bruch膜破裂標志，出血或Bruch膜未破裂则计为无效点，每眼共光凝10个有效点。

1.4 动物分组和给药

随机数字表法将30只豚鼠建立CNV模型后分为激光组、Tenon囊下组、玻璃体腔组，每组各10只，雌雄各半。激光组只进行造模处理，Tenon囊下组和玻璃体腔组分别由球后Tenon囊下和玻璃体腔注射Bevacizumab（20 μL和5 μL）。Bevacizumab球后Tenon囊下注射方法：豚鼠取仰卧位，眼部皮肤用2%碘伏消毒，局部滴0.5%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，在颞上方11：30 位角巩膜缘后约1 mm处剪开球结膜和Tenon囊，切口长约1 mm，暴露出巩膜，把弯曲成弧形的钝性针头（泪道冲洗针头自制）沿巩膜面进入赤道后部注药，注射完成后结膜囊内涂氧氟沙星眼膏。

1.5 观察指标

（1）眼底照相及吲哚菁绿血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）于光凝后21 d对各组豚鼠麻醉、散瞳、右眼拍摄眼底彩照。然后，自耳缘静脉注入吲哚菁绿注射液（6 mg/kg），行ICGA检查，测量CNV荧光素渗漏的面积。（2）视网膜HE染色 各组于ICGA结束后取右眼球进行视网膜HE染色，方法如下：应用过量乙醚麻醉处死豚鼠，迅速摘除右眼球，置于眼球固定液中，室温过夜，自来水冲洗掉残余的固定液后进行酒精梯度脱水，常规石蜡包埋后，以与视神经矢状轴平行连续切片，厚度4 μm，烘片烤片后，常规脱蜡，接着依次于100%、95%、80%和70%酒精2 min复水，最后HE染色10 min，自来水洗净残余苏木素，盐酸分化酒精10 s，1%氨水返蓝，1%伊红染色剂，脱水、透明、封片，并于光学显微镜下观察。选取包含满意激光斑的切片，量取CNV最大中央厚度，每个标本取3张切片进行统计学分析。

1.6 统计学方法

成组设计实验研究。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。所有数据均采用SPSS22.0统计软件分析处理，三组之间采用完全随机设计资料的方差分析（单因素ANOVA），两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CNV的发生率

ICGA检查结果显示各组出现荧光的激光斑个数比例（CNV发生率）从高到低分别为：激光组（65.0%）、Tenon囊下组（58.0%）、玻璃体腔组（55.0%），见表1。

2.2 各组豚鼠CNV渗漏面积比较

光凝后第21天，各组眼底彩照示光凝区边界清晰，无明显水肿，中央呈火山口样凹陷（封三图4A）。激光组ICGA早期显示边界不甚清晰的花环样CNV轮廓，CNV周围无灌注区边界亦不甚清晰（封三图4B），Tenon囊下组和玻璃体腔组ICGA早期显示CNV花环样轮廓，CNV周围无灌注区可见（封三图4C、4D）。定量分析显示Tenon囊下组和玻璃体腔组CNV渗漏面积与激光组相比差异均有统计学意义（P<0.01），而前两者之间差异无统计学意义（P>0.05）（封三图4E）。

2.3 各组豚鼠CNV最大中央厚度比较

光凝后21 d，各组视网膜HE染色示CNV激光光斑处瘢痕组织牵拉视网膜，使其凹陷。CNV斑块内，色素性巨噬细胞、成纤维细胞、胶原纤维增多，并可见迁移增殖的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和由血管内皮细胞围成的新生血管腔。三组CNV斑块内细胞成分类似（封三图5A～5C）。定量分析显示Tenon囊下组和玻璃体腔组CNV最大中央厚度与激光组相比差异均有统计学意义（P<0.01），而前两者之间差异无统计学意义（P>0.05）（封三图5D）。

3 讨论

CNV的发生机制尚未完全研究清楚，目前认为其是一种由多因素引起的病变，其病因分为眼局部因素和全身因素。眼局部因素方面，目前比较公认的是缺氧学说。该学说认为由于血循环异常、氧化损伤及炎症反应等引起组织缺血缺氧，导致局部释放出多种促血管生长因子，在促血管生长因子的作用下，异常生长的脉络膜血管突破Bruch膜进入RPE或神经上皮下生长[10]。全身因素包括动脉硬化、高血压、吸烟和阳性家族史等，紫外线和饮食则是可疑因素[11]。本研究利用氪激光作用于豚鼠RPE和脉络膜，或直接破坏Bruch膜或通过慢性炎症作用逐渐溶解Bruch膜，而引发脉络膜的损伤修复反应形成CNV。这一过程与人类CNV性疾病的病理发展过程是相似的[12]，因此氪激光诱导的CNV可以作为较理想的人类CNV性疾病模型。在此基础上，应用Bevacizumab球后Tenon囊下注射进行干预治疗，于光凝后21 d观察CNV形成情况，并与玻璃体腔注射组进行比较。ICGA检查结果显示，Tenon囊下组和玻璃体腔组CNV发生率均低于单纯激光造模组，CNV渗漏面积亦较激光组减少（P<0.01），且两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。同样，通过HE染色比较三组CNV最大中央厚度结果也是如此。说明Bevacizumab能够抑制氪激光诱导的豚鼠CNV的发育，Bevacizumab球后Tenon囊下注射和玻璃体腔注射疗效相近。

球后Tenon囊下注射是眼科常用的給药途径，主要用于眼后节疾病的治疗，依靠药物对巩膜的穿透性而达眼内发挥作用。一系列研究表明，曲安奈德不仅在眼内注射具有较好的效果，在巩膜外应用也显示了良好的治疗黄斑水肿和CNV的作用[13-15]。我们的前期研究也显示，球后Tenon囊下注射Bevacizumab可以获得较高的眼内治疗浓度（>500 ng/mL），且和常规玻璃体腔注射给药相比，全身血药浓度并无显著差异[16]。近年来亦有Bevacizumab巩膜外给药对视网膜新生血管作用的报道。刘德林等[17]通过建立早产高氧鼠视网膜病变大鼠模型，比较Bevacizumab球周注射和玻璃体腔注射对早产鼠视网膜病变的影响，发现两者疗效相近，但前者比后者更安全，这与本研究的结果是一致的。

虽然目前的研究几乎一致表明玻璃体内注射Bevacizumab可使眼部新生血管性疾病患者视力有明显提高，大幅度提高患者的生活质量，但如何避免因玻璃体内注射药物所引起的相关并发症以及长期临床使用安全性及有效性[18-20]仍需进一步探讨。本研究以氪激光诱导的豚鼠CNV为研究对象，其与人的CNV病理过程毕竟不尽相同，豚鼠眼与人眼巩膜对药物的屏障作用也存在差异，因此本研究所得出的结论有一定局限性，但仍可为Bevacizumab球后Tenon囊下注射的临床应用提供初步的实验依据。在此基础上开发通过巩膜的缓释装置可减少注射次数，使患者长期维持有用视力，从而减轻家庭与社会负担。因此对这一给药途径的应用作进一步研究有重要的临床意义及潜在的经济效益和社会效益。

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（收稿日期：2017-03-27）